猪圆环病毒通用型（PCV-U）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

[产品名称]

商品名称：猪圆环病毒通用型 （PCV-U）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name ：Porcine Circovirus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

[包装规格]25T/盒、50T/盒

[预期用途]

猪圆环病是由猪圆环病毒（PorcineCircovirus）引起猪的一种传染性、先天性颤抖和断奶仔猪多系统功能障碍性疾病，是迄今发现的最小的动物病毒之一。目前存在 PCV1、PCV2、PCV3 和 PCV4 四种血清型。PCV1 为非致病性的病毒；PCV2 为致病性的病毒；PCV3 与 PCV2 类似，可导致多系统炎症、母猪繁殖障碍（流产、死胎）等；PCV4 于2020 年发现，致病性尚待确认。目前，全球养猪业主要面临 PCV2 的挑战，但 PCV3 的流行趋势正在升温。

本试剂盒适用于检测肺、淋巴结组织、全血等样本中的猪圆环病毒通用型，包含 1-4 型，用于猪圆环病毒通用型感染的辅助诊断。

[检验原理]

本试剂盒对猪圆环病毒基因保守区设计特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术对猪圆环病毒通用型的 DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

[试剂组成]

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

[储存条件及有效期]

-20℃±5℃避光保存，有效期 12个月。避免反复冻融，冻融次数不超过 5 次；生产日期和失效日期见标签。[适用仪器]

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

[标本采集]

组织样品采集：采取病死猪（包括流产的死胎）)或扑杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏）装入灭菌 15 mL离心管中，编号，送实验室。血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于 5 ml，置于无菌离心管内，室温或者 37℃倾斜放置自然凝集 20 min ~30 min，2 000 r/min~3 000 r/min 离心 10 min，吸取上清液到新的离心管内备用。精液样品采集：按照GB/T25172的方法采集和保存精液。粪便样品采集：取猪新鲜粪便 1 g，装入 15 mI灭菌离心管中，加入 5 mLPBS，混匀。细胞培养物：细胞培养物反复冻融 3 次，第 3 次解冻后，将细胞培养物置于 1.5mL 无 DNA 酶的灭菌离心管内，编号备用。

[保存和运输]

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

[使用方法]

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：取 1 g 解冻的组织，剪碎，加入 2 mLPBS进行研磨，制备组织匀浆，8000 r/min 离心 5 min，取上清用于后续的核酸提取。血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。粪便样品：3000 r/min 离心 10min，取上清液，转入 1.5mL 离心管中，用于后续的核酸提取。细胞培养物：4000 r/min，4℃离心 l0 min，取上清用于后续的核酸提取。

1.2 核酸提取

采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL 管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40值≤45，且曲线有明显的增长

曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

[注意事项]

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

[参考文献]

[1] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 35901-2018 猪圆环病毒 2 型荧光 PCR 检测方法[S].