牛支原体（MYPB）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

[产品名称]

商品名称：牛支原体(MYPB)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name：Mycoplasma Bovis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

[包装规格]25T/盒、50T/盒

[预期用途]

牛支原体（Mycoplasma bovis）是感染牛的一种重要病原微生物，可引起牛的肺炎、乳腺炎、和关节炎等疾病。该病的临床症状与牛肺疫很相似，初期症状不明显，出现明显的临床症状时已经发生严重的肺部粘连很难治愈。由于牛支原体基因和细胞膜表面蛋白的多边性，国内外还没有非常有效的防治方法[1]。早期的及时诊断是控制该病的重要手段之一。

本试剂盒适用于检测组织、鼻腔深部分泌物、肺灌洗液等样本中的牛支原体[2]，用于牛支原体感染的辅助诊断。

[检验原理]

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对牛肺疫支原体特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对牛支原体的 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

[试剂组成]

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

[储存条件及有效期]

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

[适用仪器]

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

[标本采集]

组织样品：选取有明显病变和健康交界处组织，无菌采集病牛肺脏，剪成 3 cm~5cm 方块送实验室备用。

鼻腔深部分泌物：用无菌棉拭子深入鼻腔深部或鼻咽部，旋转擦拭黏膜 3-5 次，放入无菌采样管中。

肺灌洗液：完整摘取肺脏/肺叶，送实验室进行灌洗。

全血样品：用无菌注射器抽取静脉血不少于 5mL，置于无菌离心管内。

[保存和运输]

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

[使用方法]

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：取 0.5 g 待检样品(肺脏)于已洗净、灭菌并烘干的匀浆器中充分研磨，加 10 mL灭菌生理盐水混匀，反复冻融 3 次，3000 r/ min离心 15 min。取上清液转人无菌的 1.5 mLEppendorf管中，编号备用。鼻腔深部分泌物：加入 500μL 无菌 PBS，充分涡旋震荡 1min，反复挤压拭子取上清用于后续的核酸提取。肺灌洗液：根据肺脏/肺叶的大小，通过肺管加入 5mL~10mL 无菌 PBS，反复揉捏，吸取灌洗液，3000r/min 离心 5 min，取上清用于核酸提取。全血样品：无需进行前处理，直接用于核酸提取。

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为  ；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择ROX 参比荧光，选择None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线；

可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40值≤45，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

[注意事项]

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

[参考文献]

[1]李大伟.牛支原体 PCR 诊断方法的建立及流行病学调查[J].内蒙古农业大学, 2011

[2]中华人民共和国农业农村部. NY/T 3234—2018 牛支原体 PCR 检测方法[S].