武汉艾美捷科技有限公司

一、产品背景与检测原理

Caspase家族是一类在细胞凋亡和信号转导中发挥重要作用的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。其中，Caspase-3（又称CPP32/apopain）的激活是细胞凋亡启动进程中的关键事件，同时也是药物筛选的重要靶标。Caspase-3对底物多肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有特异性识别和剪切活性。

本试剂盒（Amplite™ 荧光法Caspase-3/7检测试剂盒，绿色荧光）采用(Z-DEVD)₂R110作为荧光指示底物，用于定量检测Caspase-3/7酶活性。其检测原理为：高纯度R110衍生底物以内酯构型存在时无色且无荧光。当该底物被Caspase-3/7特异性酶切后，释放出游离的R110荧光染料，产生强烈的绿色荧光信号。该荧光信号可在激发波长488 nm（荧光仪器中最常用的激发光源）、发射波长510～530 nm处进行荧光检测。R110衍生Caspase底物是目前广泛应用于Caspase家族酶活性荧光检测的高灵敏度指示剂之一。

本试剂盒可使用荧光微孔板酶标仪或荧光光度计，对细胞提取物和纯化酶制剂中的Caspase-3活性进行连续监测，也可与流式细胞术配合使用，用于细胞凋亡分析及Caspase-3/7活性检测。

二、试剂盒组分与储存条件

使用前请将各组分置于室温条件下解冻。未使用的储备液建议分装为单次用量，于-20°C保存，避免反复冻融。

Caspase-3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO储备液（1 mM）配制：

向Ac-DEVD-CHO（Component D）瓶中加入100 μL DMSO（试剂盒不提供），充分溶解，即得1 mM Caspase-3/7抑制剂储备液。该抑制剂可用于验证荧光信号强度与Caspase-3/7样蛋白酶活性之间的相关性。

三、工作液配制方法

取50 μL 200× Caspase-3/7底物储备液（Component A）和100 μL 1 M DTT溶液（Component C），加入10 mL检测缓冲液（Component B）中，充分混匀，即得Caspase-3/7工作液。

> 注：该工作液配制量可供100次检测使用（按每孔100 μL反应体积计）。工作液需注意避光保存。

四、实验操作流程

1. 细胞接种与化合物处理

-96孔板体系：每孔加入10 μL 10×待测化合物（溶于PBS或适宜缓冲液），并加入细胞悬液使总体积为100 μL。

-384孔板体系：每孔加入5 μL 5×待测化合物，并加入细胞悬液使总体积为25 μL。

-空白对照孔（无细胞，仅含培养基）加入相应体积的化合物缓冲液。

2. 细胞孵育诱导凋亡

将细胞培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育所需时间以诱导细胞凋亡。例如，喜树碱处理的Jurkat细胞通常需孵育4～6小时。

3. 加入检测工作液

-96孔板体系：每孔加入100 μL Caspase-3/7工作液。

-384孔板体系：每孔加入25 μL Caspase-3/7工作液。

4. 孵育反应

室温条件下避光孵育至少1小时，使酶切反应充分进行。

5. 抑制剂验证实验（可选）

如需确认Caspase-3/7样蛋白酶活性，可在加入Caspase-3/7工作液前，向选定样品孔中加入1 μL 1 mM Caspase-3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO储备液，室温孵育10分钟，再加入工作液进行检测。抑制剂处理组信号应显著低于未处理组。

6. R110标准曲线制备（可选）

如需对Caspase-3/7反应产物进行定量分析，可将5 mM R110标准品（Component E）用生长培养基进行梯度稀释，制备0～50 μM系列浓度的R110标准溶液。在荧光检测前，向含100 μL Caspase-3/7工作液的孔中加入100 μL系列稀释的R110标准品，建立标准曲线，用于计算反应体系中产物的生成量。

7. 细胞板离心（可选）

对于非贴壁细胞，可在检测前将细胞板以800 rpm离心2分钟（关闭刹车），使细胞沉降于孔底，以减少细胞散射对荧光信号的干扰。

8. 荧光信号检测

使用荧光微孔板酶标仪，在激发波长490 nm/发射波长525 nm（截止波长515 nm）处监测荧光强度。

五、关键实验参数

-检测仪器：荧光微孔板酶标仪（具备动力学读数功能）

-激发波长：490 nm

-发射波长：525 nm

-截止波长：515 nm

-推荐板型：黑色实心底微孔板

六、实验优化建议

1. 孵育时间优化

建议根据细胞类型和诱导剂活性水平进行孵育时间梯度预实验（0.5～3小时），以确保荧光信号处于仪器检测的线性范围内。

2. 细胞接种密度优化

建议根据细胞类型和实验目的优化每孔细胞接种密度，通常贴壁细胞每孔接种1×10⁴～5×10⁴个细胞（96孔板），悬浮细胞每孔接种2×10⁴～1×10⁵个细胞。

3. 阳性对照与阴性对照设置

-阳性对照：使用已知Caspase-3/7诱导剂（如喜树碱、Staurosporine或TRAIL）处理的细胞作为阳性对照。

-阴性对照：设置无细胞空白对照和无诱导剂处理的细胞对照。

-抑制剂对照：使用Ac-DEVD-CHO抑制剂预处理样品，确认信号特异性。

七、注意事项

1. 避光操作：R110荧光染料对光敏感，工作液及反应体系需注意避光保存和操作，避免长时间暴露于光照条件 下。

2. DTT浓度控制：DTT是维持Caspase酶活性的必要还原剂，请严格按照推荐浓度使用。

3. 板型选择：荧光检测需使用黑色实心底微孔板，以避免孔间信号串扰和背景荧光干扰。

4. 产物定量：如需将荧光信号转换为酶活性绝对定量值（如产物摩尔数），建议制备R110标准曲线进行换算。

5. 产品用途限制：本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗。