武汉艾美捷科技有限公司

一、产品背景与检测原理

过氧化物酶（Peroxidase）是一种小分子酶，分子量约为40kDa，通常可与抗体按4:1的比例进行偶联。由于其分子尺寸较小，在抗体/抗原复合物形成过程中几乎不产生空间位阻效应，因而在免疫检测体系中具有良好的兼容性。与其他标记酶相比，过氧化物酶的成本相对较低，具有显著的经济优势。然而，过氧化物酶的主要局限性在于其对多种防腐剂的耐受性较差，例如叠氮化钠即便在低浓度下也会使其活性丧失，因此在缓冲液体系的选择上需特别注意。

辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase，简称HRP）偶联物被广泛应用于ELISA、免疫组织化学技术以及Northern、Southern和Westernblot等分子生物学检测方法中，作为二级检测试剂发挥着关键作用。

由艾美捷代理AATBioquest推出的Amplite™荧光法过氧化物酶（HRP）检测试剂盒，红色荧光，货号：AAT-11552，提供了一种快速（仅需10分钟）、一步法、均相、免洗涤的检测体系。该试剂盒可用于ELISA体系中的酶活性评估、酶促反应动力学表征以及氧化酶抑制剂的高通量筛选等多种应用场景。试剂盒采用经过优化的“混合即读”检测方案，与高通量筛选液体处理工作站具有良好的兼容性。

相较于传统的显色法，红色荧光检测模式可有效规避生物样本自体荧光的干扰，显著提高信噪比和检测灵敏度，尤其适用于复杂基质样本中低丰度HRP活性的准确定量。

二、试剂盒组分与储存条件

使用前请将所有组分置于室温条件下解冻。未使用的储备液建议分装为单次用量，于-20°C保存，避免反复冻融。

三、储备液配制方法

1.Amplite™Red过氧化物酶底物储备液（100×）

向Amplite™Red过氧化物酶底物（ComponentA）瓶中加入250μLDMSO（ComponentE），充分溶解，即得100×底物储备液。该储备液建议现配现用，注意避光保存。

2.HRP标准品溶液（20U/mL）

向辣根过氧化物酶（ComponentD）瓶中加入1mL检测缓冲液（ComponentC），充分溶解，即得20U/mL的HRP标准品溶液。

3.过氧化氢储备液（20mM）

取22.7μL3%过氧化氢（0.88M，ComponentB）加入977μL检测缓冲液（ComponentC）中，充分混匀，即得20mM过氧化氢储备液。

>注：稀释后的过氧化氢溶液不稳定，未使用的部分应予以弃去。

四、实验操作流程

1.向检测孔中加入50μLHRP标准品或待测样品；

2.加入50μLHRP工作液；

3.室温条件下孵育10～30分钟；

4.使用荧光微孔板酶标仪，在激发波长540nm/发射波长590nm处读取荧光强度值（截止波长575nm）。该试剂盒亦可兼容吸光度检测模式，可在576±5nm波长处读取吸光度值。

五、关键实验参数

荧光检测模式：

-检测仪器：荧光微孔板酶标仪

-激发波长：540nm

-发射波长：590nm

-截止波长：575nm

-推荐板型：黑色实心底微孔板

吸光度检测模式：

-检测仪器：吸光度微孔板酶标仪

-检测波长：576±5nm

-推荐板型：透明底微孔板

六、注意事项与干扰因素

1.巯基化合物的干扰：ComponentA（Amplite™Red底物）在巯基化合物（如DTT、β-巯基乙醇）存在下不稳定。当巯基化合物终浓度高于10μM时，会显著降低检测的动态范围，请确保样品中此类物质含量在允许范围内。

2.还原性物质的干扰：NADH和还原型谷胱甘肽（GSH）可能对检测产生干扰，实验设计时应予以考虑。

3.避光操作：工作液及底物储备液需注意避光保存，避免光照导致荧光探针降解或背景升高。

4.防腐剂注意：叠氮化钠等防腐剂会抑制过氧化物酶活性，样品缓冲液及储存体系中应避免使用。

5.板型选择：荧光检测模式需使用黑色实心底微孔板，以避免孔间信号串扰和背景荧光干扰；吸光度检测模式则需使用透明底微孔板，请根据检测模式选择合适的板型。

6.复孔设置：建议每个浓度标准品及待测样品设置复孔，以保证数据的准确性和可重复性。