武汉艾美捷科技有限公司

一、产品背景与检测原理

过氧化氢（H₂O₂）是一种活性氧代谢副产物，在多种氧化应激相关状态的调控中发挥着关键的信号分子作用。大量研究表明，过氧化氢参与了诸多生物学过程，与哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病性血管病变、骨质疏松、多种神经退行性疾病及唐氏综合征等病理状态密切相关。近年来尤为引人关注的是，有研究报道抗体具有将分子氧转化为过氧化氢的能力，这一发现提示过氧化氢可能在免疫系统的正常识别与清除过程中扮演着重要角色。因此，对过氧化氢的准确检测有助于深入理解氧化应激调控多种胞内信号通路的分子机制。

由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite™ 荧光法过氧化氢检测试剂盒，红色荧光，货号：AAT-11501，采用特有的Amplite® Red过氧化物酶底物，可对溶液及细胞提取物中的过氧化氢进行定量检测。此外，该试剂盒还可通过酶偶联反应，用于检测多种氧化酶的活性。本试剂盒为经过优化的“混合即读”型检测体系，与高通量筛选液体处理工作站具有良好的兼容性，适用于大规模药物筛选及高通量实验需求。

相较于传统的比色法和绿色荧光探针，红色荧光检测可有效减少生物样品自体荧光的干扰，显著提高信噪比，尤其适用于细胞裂解液、血清等复杂生物基质样本的检测。

二、试剂盒组分与储存条件

使用前请将所有组分置于室温条件下解冻。未使用的储备液建议分装为单次用量，于-20°C保存，避免反复冻融。

三、储备液配制方法

1. Amplite® Red过氧化物酶底物储备液（100×）

向Amplite® Red底物（Component A）瓶中加入250 μL DMSO（Component E），充分溶解，即得100× 底物储备液。该储备液建议现配现用。

2. 过氧化物酶储备液（20 U/mL）

向辣根过氧化物酶（Component D）瓶中加入1 mL检测缓冲液（Component C），充分溶解，即得20 U/mL的过氧化物酶储备液。

3. 过氧化氢标准品溶液（20 mM）

取22.7 μL 3%过氧化氢（0.88 M，Component B）加入977 μL检测缓冲液（Component C）中，充分混匀，即得20 mM过氧化氢标准品溶液。

> 注：稀释后的过氧化氢溶液不稳定，任何未使用的剩余部分均应弃去，不可留存后续使用。

四、实验操作流程

1. 向检测孔中加入50 μL过氧化氢标准品或待测样品；

2. 加入50 μL过氧化氢工作液；

3. 室温条件下孵育10～30分钟；

4. 使用荧光微孔板酶标仪，在激发波长540 nm/发射波长590 nm处读取荧光强度值。

五、关键实验参数

-检测仪器：荧光微孔板酶标仪

-激发波长：540 nm

-发射波长：590 nm

-截止波长：570 nm

-推荐板型：黑色实心底微孔板

六、注意事项与干扰因素

1. 巯基化合物的干扰：Component A（Amplite® Red底物）在巯基化合物（如DTT、β-巯基乙醇）存在下不稳定。当巯基化合物终浓度高于10 μM时，会显著降低检测的动态范围，请确保样品中此类物质含量在允许范围内。

2. 还原性物质的干扰：NADH和还原型谷胱甘肽（GSH）可能对检测产生干扰，实验设计时应予以考虑，必要时可通过样品预处理去除或稀释至不干扰浓度。

3. 避光操作：工作液及底物储备液需注意避光保存，避免光照导致荧光探针降解或背景升高。

4. 板型要求：荧光检测对微孔板材质有特定要求，请务必使用黑色实心底微孔板，以避免孔间信号串扰和背景荧光干扰。

5. 复孔设置：建议每个浓度标准品及待测样品设置复孔，以保证数据的准确性和可重复性。

6. 洁净操作：实验操作中请使用无酶枪头和洁净容器，避免外源过氧化氢酶或氧化酶污染对结果产生干扰。