武汉艾美捷科技有限公司

一、谷胱甘肽检测的生物学意义与技术瓶颈

还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞内最丰富的非蛋白巯基化合物，在维持细胞氧化还原平衡，清楚活性氧自由基及解毒代谢重发挥核心保护作用。生物样品中GSH与氧化性谷胱甘肽（GSSG）的比例变化，直接反映细胞和组织的氧化应激状态机抗氧化防御能力。此外，半胱氨酸代谢异常与多种遗传性疾病密切相关--胱氨酸由溶酶体转运缺陷引起，胱氨酸尿症则为常见的长染色体隐性遗传性氨基酸转运障碍。

然而，目前市售巯基定量试剂盒普遍存在灵敏度不足或操作流程繁琐的问题，难以满足微量样品检测与高通量筛选的需求。

二、检测原理与核心性能

由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite® 荧光法谷胱甘肽定量试剂盒，货号：AAT-10055，采用专有的非荧光探针Thiolite™ Green，该探针与游离巯基包括GSH中的巯基，反应后会产生强烈的绿色荧光信号，激发/发射波长为

490/525 nm（推荐截止滤光片515 nm）。

关键性能指标：

检测下限低至1 pmol（以半胱氨酸或GSH计，100 μL体系对应10 nM浓度）

一步法操作，无需分离步骤

适配96孔或384孔黑色微孔板，兼容自动化高通量平台

三、操作流程与关键参数

3.1 仪器与材料要求

项目 | 规格

检测仪器 | 荧光微孔板读数仪

激发波长 | 490 nm

发射波长 | 525 nm

截止滤光片 | 515 nm

推荐板型 | 实心黑色微孔板

重要提示：实验开始前将所有组分恢复至室温。细胞样品的制备可参考厂商提供的细胞样品制备指南。3.2 储备液配制

GSH标准溶液（1 mM）： 向GSH标准品（组分C）小管中加入200 μL Assay Buffer（组分B），配制成1 mM（1 nmol/μL）的GSH标准溶液。

Thiolite™ Green储备液（100×）： 向Thiolite™ Green（组分A）小管中加入100 μL DMSO（组分D），配制成100×储备液。

> 备选方案： 若工作液配制过程中观察到沉淀，可改用200 μL DMSO配制成50×储备液。

3.3 标准曲线制备

取适量1 mM GSH标准溶液，用Assay Buffer进行梯度稀释，制备系列浓度的GSH标准品，推荐覆盖0 ~ 30 μM浓度范围，确保待测样品信号落在标准曲线线性区间内。

3.4 检测流程

1. 每孔加入50 μL GSH工作溶液；

2. 加入50 μL GSH标准品或待测样品；

3. 室温孵育10 ~ 60分钟；

4. 在Ex/Em = 490/525 nm处监测荧光强度增加值。

四、方法学验证与质量控制

灵敏度： 本方法在100 μL体系中检测下限达10 nM（1 pmol/孔），适用于细胞裂解液、组织匀浆等低浓度样品分析。

线性范围： 在优化条件下，GSH浓度与荧光信号在0.01 ~ 30 μM范围内呈良好线性关系（R² > 0.99）。

特异性： Thiolite™ Green探针特异性响应游离巯基，对GSH具有高选择性。样品中其它含巯基化合物如半胱氨酸，蛋白巯基也会产生信号，检测结果反映总游离巯基含量。

稳定性：配制后的GSH标准溶液不稳定，建议4小时内使用。Thiolite™ Green准备液应分装后于-20℃避光保存，避免反复冻融

五、常见问题与操作要点

1、还原剂干扰：样品中若含

DTT、β-巯基乙醇或TCEP，需预先脱盐处理，否则会导致假阳性信号；

2. pH控制： 反应体系pH建议维持在7.0 ~ 8.0之间，偏离此范围可能影响探针反应效率；

3. 孵育时间优化： 高浓度样品（>10 μM）孵育10分钟即可达到平台期，低浓度样品（<1 μM）建议延长至60分钟以确保反应完全；

4. 样品制备： 细胞或组织样品需快速处理，避免GSH在制备过程中被氧化。建议在含EDTA的缓冲液中裂解，并尽量在冰上操作；

5. 背景扣除： 每个实验板应包含空白对照（不含GSH），最终荧光信号为实测值减去空白对照值。

六、总结

Amplite® 荧光法谷胱甘肽定量试剂盒以“开启型”荧光探针为核心，在灵敏度，操作便捷性和通量适配性方面均显著优于传统试剂盒。1 pmol级的检测下限使其适用于珍贵样品如干细胞，活检组织，亚细胞组分的GSH定量分析，为氧化应激研究，药物肝毒性评估及代谢性疾病筛查提供了高效可靠的工具。