武汉艾美捷科技有限公司

一、巯基检测的生物学意义与技术挑战

巯基（—SH）广泛存在于生物体系中，涵盖游离半胱氨酸，谷胱甘肽（GSH）以及蛋白质中的半胱氨酸残基。准确测定游离巯基行亮是研究氧化应激，解毒代谢和细胞redox状态的基础性工作。谷胱甘肽作为细胞内最重要的抗氧化剂，其还原型（GSH）与氧化型（GSSG）的比例直接反映细胞对抗氧化损伤的能力。此外，半胱氨酸代谢异常与多种遗传性疾病密切相关--胱氨酸病由溶酶体转运缺陷导致，胱氨酸尿症则为常见的常染色体隐性遗传性氨基酸转运障碍。

二、检测原理与核心优势

由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite® 荧光法总巯基定量检测试剂盒（绿色荧光），货号：AAT-5528，采用专有的水溶性非荧光探针Thiolite™ Green 520WS。该探针本身无荧光背景，与巯基发生特异性反应后产生强烈绿色荧光信号，激发/发射波长为490/525 nm（截止滤光片 515 nm）。这一“开启型”荧光设计有效避免了传统淬灭型探针的背景干扰问题，实现饿了极高的信噪比。

核心性能指标：

检测限低至

- 1 pmol（以半胱氨酸或 GSH 计，100 μL 体系对应 10 nM 浓度）

-一步法操作，室温孵育 10 ~ 60 分钟即可完成

-适配96孔或384孔黑色微孔板，易于实现自动化高通量检测

三、操作流程与关键参数

3.1 仪器与耗材要求

项目 | 规格

检测仪器 | 荧光微孔板读数仪

激发波长 | 490 nm

发射波长 | 525 nm

截止滤光片 | 515 nm

推荐板型 | 实心黑色微孔板

重要提示： 实验前将所有组分恢复至室温。配制后的储备液建议分装单次用量，于 -20℃ 避光保存，避免反复冻融。

3.2 储备液配制

GSH 标准溶液（1 mM）： 向 GSH 标准品（组分 C）小管中加入 200 μL ddH₂O，配制成 1 mM（1 nmol/μL）储备液。

Thiolite™ Green 520WS 储备液（100×）： 向 Thiolite™ Green 520WS（组分 A）小管中加入 100 μL ddH₂O，配制成 100× 储备液。

3.3 标准曲线制备

取 30 μL 的 1 mM GSH 标准溶液，加入 970 μL Assay Buffer（组分 B）中，得到 30 μM（30 pmol/μL）的 GSH 工作液。取该工作液，用 Assay Buffer 进行 1:3 梯度稀释，依次得到 SD7 至 SD1 系列浓度标准品。

> 注意： 稀释后的 GSH 标准溶液稳定性较差，建议配制后 4 小时内使用完毕。

3.4 检测流程

1. 每孔加入 50 μL GSH 工作溶液；

2. 加入 50 μL GSH 标准品或待测样品；

3. 室温孵育 10 ~ 60 分钟；

4. 在 Ex/Em = 490/525 nm 处监测荧光强度增加值。

四、方法学验证与应用建议

灵敏度验证： 本方法在 100 μL 体系中对 GSH 的检测下限可达 10 nM（1 pmol/孔），远优于传统 Ellman‘s 试剂的比色法（通常检测限在 μM 级别），适合低丰度样品分析。

线性范围：通过1:3梯度稀释制备的标准曲线，在30 μM 至亚 μM 范围内呈现良好线性关系（R² > 0.99），覆盖常见生物样品的巯基浓度区间。

样品适用性：可同时检测小分子巯基化合物（GSH、半胱氨酸）及大分子蛋白上的游离巯基。若专门针对蛋白巯基定量，推荐使用同系列产品5529（经蛋白巯基检测优化版）。

五、常见问题与操作要点

1. 还原剂干扰：样品中含DTT，β-巯基乙醇或 TCEP 等还原剂时会严重干扰检测，需预先脱盐或稀释至无干扰浓度：

2、PH敏感性：反应体系PH建议维持在 7.0 ~ 8.0 之间，偏离此范围可能影响探针反应效率

3、光稳定性： Thiolite™ Green 520WS 反应产物具有良好的光稳定性，但仍建议避免长时间强光照射

4、孵育时间优化：高浓度样品（>10 μM）孵育10分钟即可达到平台期，低浓度样品

六、总结

Amplite® 荧光法总巯基定量检测试剂盒以“开启型”荧光探针为核心技术，在灵敏度，操作便捷性和通量适应性方面均显著优于传统试剂盒。1 pmol 级的检测限使其适用于干细胞裂解液，亚细胞组分，微量组织活检等珍贵样品的巯基定量分析，为氧化应激研究，药物代谢评估和遗传代谢病筛查提供了可靠的工具。