武汉艾美捷科技有限公司

一、引言：巯基检测的生物学意义与技术挑战

巯基（-SH，也称硫醇基团）在生物体系中广泛存在，涵盖小分子巯基化合物（如半胱氨酸、谷胱甘肽）以及蛋白质中半胱氨酸残基的侧链。准确检测和定量游离巯基，对于理解众多生理和病理过程具有至关重要的意义。

-谷胱甘肽（GSH）系统：作为细胞内最丰富的非蛋白巯基抗氧化剂，GSH在维持细胞氧化还原平衡、清除活性氧自由基、解毒外源化合物以及调节信号转导中扮演核心角色。检测还原型GSH与氧化型GSSG的比例，是评估细胞氧化应激状态和组织解毒能力的关键指标。

-半胱氨酸代谢紊乱：半胱氨酸水平异常与多种遗传性疾病直接相关。胱氨酸贮积症（Cystinosis）是一种常染色体隐性遗传的溶酶体转运缺陷病，导致胱氨酸在溶酶体内异常堆积，损害多器官功能；胱氨酸尿症（Cystinuria）则为常见遗传性氨基酸转运障碍，表现为胱氨酸在尿液中过饱和析出形成结石。

-蛋白质巯基修饰：蛋白质半胱氨酸残基的游离巯基参与形成二硫键以维持三级结构稳定性，同时也是氧化还原修饰（如S-亚硝基化、S-谷胱甘肽化）和金属离子配位的关键位点。

然而，生物样品中巯基的准确定量在技术上长期存在瓶颈。市售试剂盒普遍面临灵敏度不足或操作流程冗长（需多步衍生、萃取或加热）等问题，限制了其在微量样品或高通量筛选中的应用。由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite®荧光法总巯基定量检测试剂盒，货号：AAT-5524，基于专利荧光探针技术，为巯基定量提供了一套超灵敏、一步完成且易于自动化的解决方案。

二、检测原理：荧光增强型探针技术

本试剂盒的核心是专有的非荧光染料Thiolite™ Green。该探针在游离状态时荧光背景极低，但与巯基（-SH）发生特异性反应后，其分子结构发生转变，产生强烈的绿色荧光信号（激发490 nm/发射525 nm，建议使用515 nm截止滤光片）。这一“荧光开启”响应机制使得检测背景极低，信号增幅显著。

反应在室温、中性pH条件下即可高效进行，无需加热、催化剂或极端pH处理。荧光强度与样品中巯基摩尔浓度在较宽动态范围内呈线性关系。本试剂盒的检测灵敏度可达100 µL反应体系中低至1皮摩尔（pMole）半胱氨酸或GSH，相当于溶液浓度低至10 nM即可检出，灵敏度远超常规比色法和多数现有荧光法试剂盒。

对于蛋白质巯基的定量，由于蛋白分子本身可能对探针反应动力学或荧光读数产生基质干扰，建议选用同系列的优化版本（货号5529），该版本针对蛋白样品的缓冲体系和标准品进行了专门调整，可更准确反映蛋白质半胱氨酸残基的游离巯基含量。

三、试剂盒组分与通量规格

本试剂盒（货号5528）每盒提供足够进行200次检测（以96孔板计）的全部必需试剂，无需用户额外准备巯基标准品或特殊溶剂：

-组分A：Thiolite™ Green荧光探针，1管

-组分B：检测缓冲液，1瓶（25 mL）

-组分C：GSH标准品，1管（冻干粉，提供绝对定量依据）

-组分D：DMSO，1管（200 µL，用于溶解探针）

试剂盒兼容96孔板和384孔板两种规格，适配常见荧光酶标仪，可与自动化液体处理系统无缝衔接，满足从低通量研发至高通量筛选的不同需求。

四、操作流程与关键要点

第一步——储备液配制

1.GSH标准品储备液（1 mM）：取200 µL超纯水（ddH₂O）加入GSH标准品（组分C）小瓶中，充分溶解，配制成1 mM（1 nmol/µL）GSH标准储备液。该溶液需在配制后4小时内使用，因GSH易氧化降解。

2.Thiolite™ Green储备液（100×）：取100 µL DMSO（组分D）加入Thiolite™ Green探针（组分A）小瓶中，充分溶解，配制成100×储备液。注意：若在配制工作液时观察到沉淀，可用200 µL DMSO配制成50×储备液作为替代方案。

第二步——标准品梯度制备

取30 μL上述1 mM GSH储备液，加入970 μL检测缓冲液（组分B），混匀得到30 μM（30 pmol/µL）GSH工作标准品。随后以检测缓冲液为稀释液，对该30 μM标准品进行1:3倍比梯度稀释，得到一系列浓度梯度的标准品（SD7～SD1）。注意：稀释后的GSH标准品不稳定，需在4小时内使用完毕。

第三步——加样与反应

于96孔或384孔黑色微孔板中，每孔加入50 μL梯度稀释的GSH标准品或待测样品（如有必要，样品需预先进行还原处理以释放蛋白结合态或氧化态巯基，但本试剂盒检测的是游离总巯基，通常无需还原步骤）。

每孔加入50 μL新鲜配制的GSH工作液（由100× Thiolite™ Green储备液用检测缓冲液稀释至1×工作浓度制备），混匀后室温避光孵育10～60分钟（孵育时间可依据信号强度优化，以标准品最高浓度孔达到平台期而最低浓度孔仍可线性分辨为准）。

第四步——荧光读板

使用荧光酶标仪于激发490 nm、发射525 nm（截止滤光片515 nm）处读取各孔荧光强度。建议使用实心黑色微孔板以最大限度避免孔间串扰。以GSH标准品浓度对荧光强度绘制标准曲线，通过线性回归计算样品中总巯基的摩尔浓度。

五、关键注意事项

-样品前处理：若待测样品为含有高浓度蛋白质或细胞裂解液的复杂基质，建议设置基质加标回收率实验以验证定量准确性。必要时可采用蛋白沉淀或脱盐步骤去除干扰物质。

-GSH稳定性：GSH标准品溶于水相后易氧化，需即配即用，4小时内完成标准曲线的制备和测定。

-探针稳定性：Thiolite™ Green储备液在-20℃避光保存条件下稳定，但建议分装为单次使用量以避免反复冻融。工作液需现配现用。

-光照防护：Thiolite™ Green探针及相关工作液在孵育和操作过程中需避光，以防荧光淬灭。

六、应用场景与技术优势总结

本试剂盒广泛适用于：定量细胞或组织裂解液中的总游离巯基含量，以评估氧化应激水平和解毒功能；检测血浆或尿液中的半胱氨酸/胱氨酸水平，辅助相关遗传代谢病的筛查和研究；测定小分子药物或多肽中游离巯基的含量，用于原料药或中间体的质量控制；以及快速评估还原剂（如DTT、TCEP、β-巯基乙醇）处理前后样品中巯基释放量的对比研究。

技术优势集中体现在：皮摩尔级灵敏度满足微量样品检测需求；一步式操作无需萃取、加热或衍生化步骤；标准品随盒配备实现绝对定量；室温反应对热不稳定样品友好；通量灵活适配手动或自动化平台。

综上所述，Amplite®荧光法总巯基定量检测试剂盒以其超灵敏的荧光开启探针技术、极简的操作流程和完备的标准品体系，有效解决了生物巯基定量中长期存在的灵敏度和操作便利性之间的矛盾，是氧化应激研究、代谢病筛查、蛋白质修饰分析和药物质控中值得信赖的检测工具。