武汉艾美捷科技有限公司

一、引言：马来酰亚胺定量面临的挑战

在生物偶联技术领域，马来酰亚胺基团因其对巯基的高度选择性，被广泛应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸或蛋白质-小分子药物的交联反应中。典型的应用场景包括：利用SMCC、Sulfo-SMCC等异型双功能交联剂将马来酰亚胺基团引入载体蛋白或抗体分子，再与含游离巯基的药物、多肽或酶进行偶联。在这一工艺流程中，准确测定第一蛋白上所引入的马来酰亚胺基团数量，是控制偶联产物质量、确保批间一致性和优化投料比的关键环节。

然而，目前市面上可用的马来酰亚胺定量试剂或试剂盒极为有限。现有的商业化产品普遍存在操作流程繁琐、耗时长、灵敏度不足或需要使用有害有机溶剂等局限，难以满足高通量筛选或工艺开发中快速质控的需求。针对这一技术空白，由艾美捷代理AAT Bioquest推出的基于专利荧光探针技术的Maleimide Green™马来酰亚胺定量检测试剂盒，货号：AAT-5523，提供了一套灵敏、快速且易于自动化的解决方案。

二、检测原理：荧光增强型探针技术

Maleimide Green™定量试剂盒的核心是一种专有的荧光染料Maleimide Green™，该染料本身在溶液中荧光背景极低，但与马来酰亚胺基团发生特异性反应后，其荧光强度显著增强。利用这一“荧光开启”响应机制，通过测定反应前后荧光信号的增幅，即可对样品中的马来酰亚胺进行精准定量。

检测体系的反应路径如下：样品中游离的或蛋白质/纳米颗粒表面的马来酰亚胺基团与Maleimide Green™探针在温和条件下发生亲核加成反应，形成共价加合物，伴随荧光发射增强。激发波长490 nm、发射波长525 nm（建议使用515 nm截止滤光片）处的荧光强度与马来酰亚胺浓度在较宽范围内呈良好线性关系。本试剂盒的检测灵敏度可达100 µL反应体系中低至10皮摩尔（pMole）马来酰亚胺，相当于溶液浓度低至100 nM即可检出，满足绝大多数蛋白偶联产物的定量需求。

与传统基于显色反应的定量方法相比，荧光法灵敏度高出1～2个数量级，且不受样品中蛋白质本身吸光度的干扰，尤其适用于蛋白浓度较低或本身带有颜色的偶联中间体质控。

三、试剂盒组分与通量规格

本试剂盒（货号5523）每盒可供200次检测（以96孔板计），所有必需试剂均包含在内，用户无需额外准备特殊溶剂或标准品：

-组分A：Maleimide Green™荧光探针，1管（冻干或固体形式）

-组分B：反应缓冲液，1管（500 µL）

-组分C：检测缓冲液，1瓶（25 mL）

-组分D：N-乙基马来酰亚胺标准品，1管（10 mM，50 µL）

-组分E：DMSO，1管（200 µL）

其中，组分D为马来酰亚胺标准物质，用于制备标准曲线，实现绝对定量；组分E为无水DMSO，用于溶解探针。试剂盒设计兼容96孔板和384孔板两种规格，便于根据样品通量灵活选择，并可直接集成于自动化液体处理平台。

四、操作流程与关键要点

第一步——储备液配制  

将组分E（DMSO）取20 µL加入组分A（Maleimide Green™）小瓶中，充分溶解，配制成500× Maleimide Green™储备液。该储备液需分装保存于-20℃，避免反复冻融。注意：10 µL该储备液即可支持一整块96孔板的检测。

第二步——20×反应混合物制备  

取10 µL 500× Maleimide Green™储备液，加入250 µL反应缓冲液（组分B），充分混匀，配制成20×反应混合物。将上述混合物于室温避光孵育至少30分钟。此步孵育极为关键——探针需在反应缓冲液中充分活化/平衡，才能获得最佳信背比。孵育完成后应观察到溶液呈现黄色。

第三步——工作液配制  

将全部20×反应混合物转移至组分C（检测缓冲液，5 mL）中，充分混匀，即为Maleimide Green™工作液。注意：该工作液不稳定，需在配制后1小时内使用，建议现配现用。

第四步——标准品与样品准备  

取50 µL系列稀释的N-乙基马来酰亚胺标准品（由组分D梯度稀释制备）或待测样品，加入96孔板各孔中。对于蛋白样品的马来酰亚胺定量，需确保蛋白浓度和缓冲液组分与标准品体系一致，以消除基质效应。

第五步——反应与读板  

每孔加入50 µL Maleimide Green™工作液，混匀后室温孵育5～30分钟（孵育时间可优化，以信号达到平台期为准）。于荧光酶标仪读取激发490 nm/发射525 nm处的荧光强度，使用标准曲线计算样品中马来酰亚胺的摩尔含量，除以蛋白摩尔量即可得到标记率（即每分子蛋白携带的马来酰亚胺个数）。

五、应用场景与产品选型建议

（一）蛋白质马来酰亚胺基团定量  

对于经SMCC、Sulfo-SMCC、GMBS等含马来酰亚胺交联剂活化的抗体、载体蛋白（如KLH、BSA）或酶，建议选用货号5526（试剂盒5523的蛋白定量优化版本）。该版本在缓冲体系和操作提示中针对蛋白样品基质进行了专门优化，可更准确反映蛋白结合态马来酰亚胺的含量。

（二）纳米颗粒马来酰亚胺基团定量  

对于表面功能化修饰有马来酰亚胺基团的纳米颗粒（如金纳米粒、磁性微球、脂质体、聚合物纳米粒等），建议选用货号5525。纳米颗粒样品往往存在光散射效应和沉降问题，该优化版本通过调整测定波长或预处理方式，有效降低了散射干扰，定量结果更为可靠。

（三）常规科研用途  

货号5523作为通用型试剂盒，适用于蛋白、多肽、小分子及大部分纳米颗粒样品的马来酰亚胺定量，适合日常质控和方法学开发。

文献参考：

A new maleimide-bound acid-cleavable solid-support reagent for profiling phosphorylation

Authors: Chowdhury SM, Munske GR, Siems WF, Bruce JE.

Journal: Rapid Commun Mass Spectrom (2005): 899

Determination of WR-1065 in human blood by high-performance liquid chromatography following fluorescent derivatization by a maleimide reagent ThioGlo3

Authors: Chen J, Lu Z, Lawrence TS, Smith DE.

Journal: J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci (2005): 161

Quantitation of microparticles released from coated-platelets

Authors: Dale GL, Remenyi G, Friese P.

Journal: J Thromb Haemost (2005): 2081

Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals

Authors: Natarajan A, Xiong CY, Albrecht H, DeNardo GL, DeNardo SJ.

Journal: Bioconjug Chem (2005): 113

Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides

Authors: Li J, Xu Q, Cortes DM, Perozo E, Laskey A, Karlin A.

Journal: Proc Natl Acad Sci U S A (2002): 11605