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不同来源酵母浸粉对大肠杆菌生长性能的影响

一、实验背景与目的

LB培养基是微生物学实验中最常用的基础培养基，酵母粉作为核心氮源组分，直接影响细菌的生长速率和最终菌体密度。本次实验通过筛选大肠杆菌在LB培养基中的生产情况，从而确定不同来源酵母浸粉的适用程度。实验对比了三个酵母粉品牌：LB-Ref（JSENB进口,货号JS0685） 、LB-1（X厂家） 和LB-2（摩莱国产，货号MG58042） 。胰蛋白胨统一选用JSENB(货号JS0688)原料，氯化钠统一选用JSENB（货号JS0492）原料，以排除其他变量干扰。

二、实验设计

2.1液体LB摇瓶培养初筛（OD₆₀₀生长曲线测定）

2.1.1 材料与试剂

- 待筛选LB液体配方（LB-1 X厂家酵母浸粉、LB-2摩莱酵母浸粉）、对照LB-Ref（JSENB进口）酵母浸粉。

- 待活化的目标菌株（大肠杆菌）

- 无菌娃哈哈、无菌枪头、锥形瓶、比色皿

- 分光光度计/酶标仪（波长600 nm）、恒温摇床、超净台

2.1.2 培养基配制

- 按配方配制各LB培养基，每组LB及LB-Ref各配制1瓶（每瓶300 mL，压前调PH至7.2，高压后各分装4瓶，50ml/瓶，其中一瓶做空白，便于接种和取样）。合计共配制3个配方，分装12瓶液。

2.1.3  菌株活化，菌株 → 活化（菌种无需解冻直接挑取一小块即可）

- 从冰箱取出菌株，接种至10 mL LB-Ref液体培养基，37℃、200 rpm振荡培养。

- 取菌块一块小块→10 mL 液体LB 里（JSENB,货号JS0685）标记①

- 取菌块一块小块（略小）→10 mL 液体LB 里（JSENB,货号JS0685）标记②

- 37℃，200 rpm 摇床 过夜 12～16 h（空白培养基一起培养，作0标使用）

→ 选OD值为0.6-1.5的菌液作为种子液（0.6-,0.1对数中期，效果最佳）

2.1.4  接种与培养

- 种子液稀释

如种子液OD值偏高可用无菌LB-Ref将活化后的种子液稀释至OD₆₀₀≈0.6-0.1，作为统一接种源。

- 接种操作

向各LB及LB-Ref的培养瓶中，按1%（v/v）比例接种稀释后的种子液（如50 mL培养基接种0.5 mL种子液）。

空白对照不接种。

- 培养条件

所有样品与空白均置于37℃、200 rpm摇床中培养，记录起始时间（0 h）。

2.1.5  OD值测定（关键步骤）

- 仪器准备

开启分光光度计/酶标仪，预热15–30 min，设置检测波长为600 nm。

用75%酒精擦拭比色皿，确保无指纹、污渍或气泡。

- 起始OD（0 h）测定

· 取各LB及LB-Ref的空白对照液体，加入比色皿（体积2mL，与样品一致）。

· 将空白对照放入仪器，点击“调零/Blank”，将该LB的空白OD校准为0.000。

· 取出空白，放入对应LB的样品液（0 h取样），读取OD值，记为OD₀。

· 计算起始OD净值：OD₀净 = OD₀ - 空白OD。

· 重复步骤2–4，完成所有LB及LB-Ref的起始OD测定。

· 时间点OD测定

- 按实验设计，在培养过程中选取关键时间点（如2 h、4 h、6 h），重复上述步骤：

· 用对应LB的空白调零。

· 测定样品OD值，记录为ODₜ。

· 计算ODₜ净 = OD - 空白OD。

- 绘制简易生长曲线：以时间为横轴，OD净值为纵轴，观察生长趋势。

- 终点OD测定

· 选取培养终点（如12 h或24 h），按上述方法测定所有样品的OD值，计算终点OD净值，作为核心筛选指标。

2.1.6  观察记录项

每种LB在配好后、灭菌后、培养终点三个节点均拍照记录：颜色深浅、有无沉淀/絮状物、是否起泡/挂壁、空白OD本底值。

2.2固体LB平板复筛验证

2.2.1 材料与试剂

- 待筛选LB固体配方（LB-1X厂家、LB-2摩莱）、对照LB-Ref（JSENB进口）酵母浸粉。

- 待活化的目标菌株（大肠杆菌）

- 无菌娃哈哈、无菌枪头、锥形瓶、比色皿、一次性无菌平板

- 分光光度计/酶标仪（波长600 nm）、恒温摇床、超净台、恒温培养箱

2.2.2 培养基配制

- 配制LB-Ref液体培养基用于菌种活化，配制量125ml。培养基原始PH6.76，调PH至7.2后，121℃灭菌20min。

-按配方配制各LB固体培养基，LB及LB-Ref各配制1瓶（每瓶300 mL，压前调PH至7.2，高压后50-60℃倾倒平板，每种15个平板备用。

2.2.3  菌株活化，菌株 → 活化（菌种无需解冻直接挑取一小块即可）

- 从冰箱取出菌株，接种至10 mL LB-Ref液体培养基（菌块直径约4mm），37℃、200 rpm振荡培养。 过夜 12～16 h（空白培养基一起培养，作0标使用）

→ 选OD值为0.6-1.5的菌液作为种子液（0.6-,0.1对数中期，效果最佳）

2.2.4  平板涂布与培养

- 菌液稀释

用0.9%生理盐水将待测大肠杆菌菌液进行梯度稀释，得到10^-5、 10^-6  、 10^-7  、 10^-8稀释体系。

- 涂布操作

分别吸取各梯度菌液100μL均匀涂布至LB固体平板，每一稀释梯度设置3组平行。

设置空白对照组，吸取100 μL无菌生理盐水涂布平板，其余培养条件与样品组保持一致，验证稀释体系与操作过程是否存在杂菌污染。

- 培养条件

所有样品与空白均置于37 ℃恒温培养箱倒置培养48小时。

三、结果与分析

3.1培养基外观与PH对比

压前、压后图片对照

外观对比分析：

摩莱酵母浸粉在配制后即呈现黄色透亮、色泽纯净的外观，与JSENB对照品质相当。相比之下，X厂家酵母浸粉配制时颜色偏深、略有杂质，表明其原料纯度或加工工艺不及摩莱。

三组pH经高压灭菌后均稳定在7.02-7.03，但摩莱国产在溶后pH（6.06）上更接近中性，更有利于维持培养基的初始缓冲状态。

3.2 液体培养大肠杆菌生长曲线对比

各组大肠杆菌振荡培养过程中，分别在0 h、2.5 h、4.5 h、6 h、22 h取样，测定菌液OD₆₀₀，以OD₆₀₀表征菌体浓度，每组平行取平均值，绘制大肠杆菌生长曲线。结果表明LB-1、LB-2两组菌体浓度均优于LB-Ref对照组；培养终点LB-1菌体浊度更高，LB-2对数阶段增殖平稳，生长趋势均衡。

3.3不同培养节点菌体状态拍照记录（液体培养）

3.4固体平板菌落生长对比

有效计数梯度为10^-5

剔除LB‑2超标平板数据，结果显示LB‑Ref菌落数量更高；两种培养基均可培养大肠杆菌，LB‑Ref营养性能略优。

3.4综合结果比对

结论：本次平行对照试验表明，LB-2（摩莱国产）可替代LB-Ref（JSENB/进口）开展大肠杆菌纯化、菌种复苏等基础培养；二者营养水平存在小幅差距，定量实验、高菌体产量培养需先进行小试，不建议直接替代。