武汉艾美捷科技有限公司

RNA聚合酶II（RNAPII）是真核生物转录机器的核心催化酶，负责mRNA前体及多种功能性非编码RNA的合成。其最大亚基RPB1（GeneID 5430）C端重复结构域（CTD）的磷酸化修饰状态与转录周期密切偶联——丝氨酸2（Ser2）的磷酸化标志着转录从启动延伸至转录活性区，是检测基因活跃转录状态的经典分子标记。由艾美捷代理Bethyl推出的一款亲和纯化兔抗RNA聚合酶II磷酸化（S2）抗体（货号：A300-654A），为转录调控、表观遗传及基因表达动态研究提供规范化工具参考。

一、产品基本规格与表位特异性

该抗体为兔源多克隆IgG，以完整免疫球蛋白分子形式提供，未经标记（Unconjugated），为用户自主选择检测体系保留了充分空间。其关键质控参数如下：

1.免疫原与磷酸化特异性：免疫原为人工合成的磷酸化短肽，对应人RNA聚合酶II CTD重复序列YSPTSPS中丝氨酸2（Ser2）位点及其侧翼氨基酸。该抗体的识别依赖于Ser2位点的磷酸化修饰状态，适用于检测转录延伸及加工阶段的RNAPII活性形式。

2.纯化工艺与浓度：采用磷酸化表位特异性亲和层析纯化，将目标磷酸化肽段固定于固相载体，从抗血清中特异捕获识别该修饰的抗体组分，有效排除非磷酸化表位或其它CTD重复序列的交叉识别。抗体浓度为200 µg/mL（基于A280测定，1 mg/mL IgG对应吸光值1.4）。

3.保存体系与稳定性：储存于含0.1% BSA（稳定蛋白，降低管壁吸附）和0.09%叠氮化钠（防腐剂）的Tris缓冲盐溶液（TBS）中。2-8°C冷藏条件下可稳定保存一年。

二、推荐应用与实验条件

该抗体覆盖免疫印迹（WB）、免疫沉淀（IP）和免疫组织化学（IHC）三种核心应用场景，各应用的建议工作条件如下：

应用 | 推荐工作条件 | 关键实验提示

Western Blot（常规） | 1:2,000 - 1:10,000 |凝胶选择：建议使用3-8% Tris-醋酸凝胶以良好分离高分子量RPB1（约220 kDa）。封闭/稀释：5%脱脂牛奶-TBST，一抗4°C孵育过夜。二抗：推荐抗兔IgG H&L链抗体（如A120-101P）。

Western Blot（IP后检测） | 同左，但需注意二抗选择 |关键变更：使用抗兔IgG轻链HRP偶联二抗，并在封闭缓冲液中添加5%正常猪血清（S100-020），以阻断免疫沉淀中重链和轻链的干扰信号。

免疫沉淀（IP） | 6 µg抗体 / mg蛋白裂解液 | 根据裂解液总量按比例计算抗体用量。建议设置同型IgG阴性对照以区分特异性富集与非特异性结合。

免疫组织化学（IHC） | 1:200 - 1:1,000 |必须进行抗原修复：使用pH 6.0柠檬酸盐缓冲液对FFPE切片进行热诱导抗原修复。建议从1:500起始摸索。

IP-WB特殊注意事项：免疫沉淀后检测时，常规抗兔IgG H&L链二抗会同时识别IP抗体（约55 kDa重链和25 kDa轻链），产生严重干扰条带，遮蔽目标蛋白（~220 kDa）。因此必须改用抗兔IgG轻链特异性HRP二抗，并配合正常猪血清封闭，以消除重链干扰，确保靶蛋白条带的清晰可辨。

三、靶蛋白生物学背景与操作注意事项

靶蛋白背景：RPB1是RNA聚合酶II的最大亚基（约220 kDa），与第二亚基共同构成聚合酶的活性中心。其C端CTD由高度保守的七肽重复序列YSPTSPS组成，Ser2磷酸化（即本抗体靶标）在转录延伸和mRNA加工（如加帽、剪接、多聚腺苷酸化）中发挥关键调控作用。该修饰水平与基因转录活性正相关，是染色体免疫共沉淀（ChIP）和转录动力学研究中的常用参数。

关键操作注意事项：

1.磷酸酶保护：磷酸化表位对内源性和外源性磷酸酶高度敏感。裂解缓冲液中务必添加新鲜配制的磷酸酶抑制剂（如正钒酸钠、β-甘油磷酸、氟化钠），并尽量在冰上操作，避免反复冻融导致去磷酸化。

2.SDS-PAGE分离优化：RPB1分子量约220 kDa，常规10%聚丙烯酰胺凝胶无法有效分离。务必使用3-8%梯度Tris-醋酸凝胶或替代的预制大分子量凝胶体系，并适当延长电泳时间以充分分离高分子量区域。

3.蛋白酶抑制：同时添加蛋白酶抑制剂混合物（含PMSF、抑肽酶、亮肽素等），防止220 kDa的完整RPB1被降解为小片段，产生不可信的条带分布。

4.阳性对照建议：可使用经转录抑制剂（如放线菌素D）处理或血清刺激的细胞裂解液作为阳性对照，磷酸化Ser2信号应随转录活性变化呈现可预期的动态改变。

四、总结

综上所述，该款亲和纯化的兔抗RNAPII磷酸化（S2）特异性抗体凭借其明确的磷酸化表位专一性、严格验证的IP-WB兼容性以及多平台通用性（WB/IP/IHC），为转录延伸过程研究提供了可靠的检测工具。遵循推荐的凝胶体系（3-8% Tris-醋酸）、IP抗体用量（6 µg/mg裂解液）及IP后检测的特殊二抗方案，配合磷酸酶和蛋白酶抑制剂的双重保护，可望获得特异、清晰、可重复的检测结果，为基因转录调控研究提供有力的方法学支撑。