武汉艾美捷科技有限公司

在蛋白质表达定量分析中，内参检测的准确性与重复性直接决定实验数据的可信度。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为糖酵解通路中的关键酶，因其在大多数组织细胞中恒定高表达，被广泛用作Western Blot（WB）和免疫组织化学（IHC）的标准内参蛋白。由艾美捷代理Bethyl推出的一款亲和纯化的兔抗GAPDH多克隆抗体（货号A300-641A），为科研人员提供该工具抗体的规范化应用参考。

一、产品基本规格与生化特性

该抗体为兔源多克隆IgG，以完整免疫球蛋白分子形式提供，未经标记（Unconjugated），为用户自主选择二抗标记体系保留了充分空间。其关键质控参数如下：

1. 免疫原与表位定位：免疫原对应人GAPDH蛋白第225至275位氨基酸区域，具体识别表位位于第250至300位残基之间（参考序列NP_002037.2，GeneID 2597）。该区域选择避免了与其它脱氢酶家族成员的高度同源区，有助于提升靶向特异性。

2. 纯化工艺与浓度：采用抗原特异性亲和层析纯化，将目标表位肽段固定于固相载体，从抗血清中特异捕获GAPDH抗体，有效去除血清中非特异性干扰蛋白。抗体浓度为200 µg/mL，浓度测定依据比尔定律（1 mg/mL IgG在280 nm波长处吸光值为1.4），便于实验者进行精确的稀释计算。

3. 保存体系与稳定性：抗体储存于Tris缓冲盐溶液（TBS）中，添加0.1%牛血清白蛋白（BSA）作为稳定蛋白以降低管壁吸附损失，含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。在2-8°C冷藏条件下可稳定保存一年，无需反复冻融，有利于维持抗体活性的长期一致性。

二、推荐实验条件与稀释比例

针对不同应用场景，该抗体提供了经质量验证的稀释梯度。建议在所列范围内根据具体样本类型进行预实验优化，以获得最佳信噪比。

应用 | 推荐稀释比例 | 关键实验条件提示

蛋白质印迹（WB） | 1:2,000 - 1:10,000 | 封闭与稀释：使用5%脱脂牛奶-TBST溶液进行封闭和抗体稀释。孵育：推荐4°C孵育过夜，以确保低丰度抗原充分结合。检测：建议使用HRP标记的抗兔IgG二抗（如A120-101P）进行信号放大。

免疫组织化学（IHC） | 1:100 - 1:500 | 必须进行抗原修复：对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，推荐使用pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液进行热诱导抗原修复（HIER），以恢复交联掩蔽的表位免疫反应性。

稀释策略提示：GAPDH在常见细胞系和组织中表达丰度极高，建议初次实验时从1:5,000（WB）或1:250（IHC）开始摸索，根据信号强度和背景情况上下调整。过度浓缩易导致非特异性条带或弥散性背景染色。

三、靶蛋白生物学背景与实验注意事项

GAPDH（GeneID 2597，Uniprot P04406）传统上被认为仅参与糖酵解代谢——催化甘油醛-3-磷酸在NAD⁺和无机磷酸存在下氧化磷酸化为1,3-二磷酸甘油酸。然而近年研究揭示其具有多重"兼职"功能，包括参与囊泡运输、DNA复制与修复、细胞骨架调控以及tRNA核输出等非代谢过程。此外，GAPDH还具备肽基-半胱氨酸S-亚硝基化酶活性，提示其在氧化还原信号传导中亦扮演角色。

关键操作注意事项：

1. 防腐剂兼容性：缓冲液中含0.09%叠氮化钠，该化合物可抑制HRP活性。若采用HRP化学发光检测体系，务必在二抗孵育前通过充分洗涤（建议3次×5分钟以上）完全去除叠氮化钠，否则可能导致信号显著衰减甚至完全淬灭。

2. 分子量确认：GAPDH蛋白的理论分子量约为36-38 kDa（实际迁移率可能因凝胶体系和缓冲条件而异）。WB结果分析时应以预染蛋白Marker为参照，确保目的条带位于正确位置，避免与分子量相近的非特异性条带混淆。

3. 种属适用性：已验证在小鼠（Mouse）和人（Human）样本中具有反应性。用于其它物种（如大鼠、猴等）时，建议通过BLAST比对免疫原序列与目标物种GAPDH的同源性，评估交叉反应概率，必要时增设阴性对照予以验证。

4. BSA干扰风险：该抗体稀释液中含BSA，若实验涉及BSA作为封闭剂，则兼容性良好。但若二抗体系存在抗BSA交叉反应性，需留意背景控制。

四、总结

综上所述，该款亲和纯化的兔抗GAPDH多克隆抗体在特异性、效价和稳定性方面具备明确的技术规格支撑。遵循推荐的WB（1:2,000-1:10,000）和IHC（1:100-1:500）稀释区间，配合严格的抗原修复和洗涤流程，可获取特异、清晰且背景可控的检测结果。其作为分子量约37 kDa的内参标记物，适用于细胞裂解液、组织匀浆及FFPE切片的靶蛋白表达校正，是蛋白质定量分析中可靠的内参检测工具。