武汉艾美捷科技有限公司

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）及其还原形式（NADPH）是细胞中至关重要的辅酶对，在物质合成与抗氧化防御中扮演着不可替代的角色。NADP⁺与NAD⁺的结构差异在于腺嘌呤核苷酸2'位连接了一个磷酸基团，这一细微变化使其功能专一性转向合成代谢。NADPH作为关键的还原当量供给者，为脂肪酸从头合成，胆固醇生成，核苷酸合成等生物合成途径提供必须的还原力，在植物叶绿体中，NADP⁺则是光合作用反光反应阶段的重要电子受体，其还原生成的NADPH随后被用于卡尔文循环中的二氧化碳固定。准确测定总NADP和NADPH的含量，对于研究脂质代谢调控，氧化应激应答，光合作用效率以及肿瘤代谢重编辑等具有重要的科学价值。

传统的NADP和NADPH检测方法依赖于340nm波长下监测NADPH的紫外吸收。然而，这种经典方法在实际应用中面临诸多局限：首先，340nm处于紫外区域，细胞裂解液，血清，组织匀浆以及植物提取物中大量背景物质在该波段均有吸收，造成严重的光学干扰，影响检测准确性；其次，紫外检测需要昂贵的石英材质微孔板，增加了实验成本；第三，该方法灵敏度有限，难以满足微量样本或低丰度NADP(H)的检测需求。这些固有缺陷限制了传统紫外法在高通量筛选和复杂生物样本分析中的应用。

为从根本上解决上述问题，由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite™ 比色法总NADP和NADPH检测试剂盒，货号：AAT-15260，提供了一套优化完备的解决方案。该试剂盒基于高特异性酶魂环反应，将检测信号转移至可见光区（575 ± 5 nm），在灵敏度，抗干扰性和操作便捷上实现了全面提升。

一、检测原理与技术优势

本试剂盒的核心是酶循环放大系统。体系中的专一性酶能够精准识别NADP⁺和NADPH，将其不断循环转化，每一次循环都伴随显色信号的生成。这种循环机制使得检测信号随时间累积放大，相比传统紫外法的单次测量，灵敏度显著提高，能够检测皮摩尔（pmol）级别的NADP(H)。更重要的是，系统内的酶对NADP(H)具有高度专一性，与NAD(H)无交叉反应，确保了检测结果反映的是真实的NADP(H)水平，无需从样本混合物中预先纯化目标物，大幅简化了前处理步骤。

在信号输出方面，该试剂盒采用比色法（Colorimetric）检测模式，在 575 ± 5 nm 波长处读取吸光度。将检测波长从紫外区移至可见光区带来了两大核心优势：

1、显著降低背景干扰：绝大多数生物样本在575 nm可见光区域的背景吸收极弱，有效降低了空白信号，显著提高了信噪比，尤其对于植物组织裂解液，含酚红的细胞培养基货血清等复杂样本，抗干扰能力远优于紫外法。

2、适用常规耗材与仪器：检测可在普通透明底微孔板中进行，无需昂贵的石英板，且适配大多数常规吸光度酶标仪，大幅降低了设备门槛和耗材成本。

二、实验关键参数与材料准备

在开始实验前，请确认以下关键参数和准备工作

仪器设置：使用具有吸光度检测功能的酶标仪，推荐使用透明底微孔板，检测波长设定为 575 ± 5 nm。

试剂解冻：实验开始前，将所有试剂盒组分在室温下完全解冻

储存建议：未使用的储备液建议分装成单次使用量，储存于-20°C，并避免反复冻融

三、溶液配制指南

正确的溶液配制是保障实验结果准确性的前提。请严格遵循以下步骤：1.NADPH标准品储备液（1 mM）制备：

向NADPH标准品（组分C）的小瓶中添加 200 µL 的 1X PBS 缓冲液，充分混匀，即得到浓度为 1 mM（1 nmol/µL） 的NADPH标准储备液。

2.梯度标准品制备（建议现配现用）：

取 10 µL 上述1 mM NADPH标准储备液，加入到 990 µL 的 1X PBS 缓冲液 中，混匀，得到 10 µM（10 pmol/µL） 的NADPH标准溶液（标记为NS7）。

取该10 µM溶液，用1X PBS缓冲液进行 1:3 倍比稀释，依次制备得到系列梯度浓度标准品（NS7至NS1）。

注意：稀释后的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用，建议现配现用。

3. NADP/NADPH工作液制备：

（注：根据资料，工作液制备方式为将NADP/NADPH传感器缓冲液加入循环酶混合物中混匀。具体体积请参考试剂盒说明书。）

将NADP/NADPH传感器缓冲液（组分B） 全部加入到含有 NADP/NADPH循环酶混合物（组分A） 的瓶中，充分混合均匀。

注意：工作液应现配现用，并注意避光保存。

四、简要操作流程

该试剂盒的操作流程极为简洁，概括如下：

1.加样：在透明底微孔板中分别加入 50 µL 的NADPH梯度标准品或待测样品。

2.加工作液：每孔加入 50 µL 新配制的NADP/NADPH工作液。

3.孵育：在室温下避光孵育 15分钟至2小时。孵育时间可根据目标灵敏度进行灵活优化，时间越长信号强度越高。

4.读取：使用吸光度酶标仪，在 575 ± 5 nm 波长处读取吸光值。

总结：

Amplite™ 比色法总NADP和NADPH检测试剂盒通过高特异性酶循环反应与可见光比色检测技术的有机结合，成功解决了传统紫外法灵敏度低、干扰大的核心痛点。其“加样-孵育-读板”的超简流程、无需纯化的便捷操作，以及兼容常规透明底微孔板和普通吸光度酶标仪的通用型，为研究脂质代谢，光合作用，氧化还原平衡以及药物靶向NADPH代谢的干预策略提供了一款即用型，高性价比的高效工具。