武汉艾美捷科技有限公司

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）及其还原形式（NADPH）是细胞中仅次于NAD(H)的重要辅酶对。与主要参与能量代谢（分解代谢）的NAD(H)不同，NAD(H)的核心角色集中在合成代谢和抗氧化防御。NADP⁺通过酯键在腺嘌呤核苷酸2'位连接一个磷酸基团而形成，这一结构差异使其能够作为氢负离子的专一性传递体。NADPH作为强效还原剂，为脂肪酸从头合成，胆固醇生成，核苷酸合成等关键生物合成途径提供必须的还原当量；在植物叶绿体中，NADP⁺则是光合作用光反应阶段的重要电子受体，其还原生成的NADPH随后被用于暗反应（卡尔文循环）中的二氧化碳固定。准确测定NADP⁺和NADPH的含量与比值，对于研究脂质代谢调控，氧化应激应答，光合作用效率以及肿瘤代谢重编程等具有不可替代的价值。

传统的NADP/NADPH检测沿袭了NADH/NAD⁺的紫外吸收法，即在340 nm波长下监测NADPH的吸光度变化。然而，这种方法在应用于NADP(H)体系时面临诸多挑战：首先，340 nm处于紫外区域，细胞裂解液、血清或组织匀浆中大量背景物质（如蛋白质、核酸、某些色素）均在此波长有吸收，造成严重干扰；其次，紫外检测需要昂贵的石英材质微孔板，增加了实验成本；第三，该方法的灵敏度有限，难以满足微量样本或低丰度NADP(H)的检测需求。

为从根本上解决上述问题，由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite™ 荧光法总NADP/NADPH检测试剂盒（红色荧光） ，货号：AAT-15259，提供了一套优化完备的解决方案。该试剂盒基于高特异性酶循环反应，并创新性的将检测信号转移至可见红光区域，在灵敏度，抗干扰性和操作便捷性上实现了全面提升。

一、检测原理与技术优势

本试剂盒的核心是酶循环放大系统。体系中的专一性酶能够精确识别NADP⁺和NADPH，将其不断循环转化，每一次循环都伴随信号分子的生成。这种循环机制使得检测信号随时间指数级累积，相比传统紫外法的单次测量，灵敏度提高了数十至数百倍，能够检测皮摩尔（pmol）级别的NADP(H)。更重要的是，系统内的酶对NADP(H)具有高度专一性，与NAD(H)无交叉反应，确保了检测结果反映的是真实的NADP(H)水平，无需从样品混合物中预先纯化目标物。

在信号输出方面，该试剂盒采用红色荧光检测模式（激发波长540 nm，发射波长590 nm，截止波长570 nm）。将检测波长从紫外区移至可见红光区带来了两大核心优势：

1、极低的背景干扰：绝大多数生物样本在红光区域的自身荧光和光吸收极弱，这有效降低了空白信号，显著提高了信噪比。尤其是对于植物组织，有色培养基货血清等复杂样本，抗干扰能力远优于紫外法。

2、适用常规耗材与仪器：检测可在普通透明底或黑色微孔板中进行，无需石英板，且适配大多数常规荧光酶标仪，大幅降低了设备门槛和耗材成本。

此外，试剂盒还兼容吸光度检测模式（吸收波长576 ± 5 nm），为不具备荧光读取能力的实验室提供了灵活性。

二、实验关键参数与材料准备

在开始实验前，请确认以下关键参数和准备工作：

仪器设置（荧光模式）：使用荧光酶标仪，推荐黑色实心底板微孔板，检测参数：

激发光（Ex）540 nm，发射光（Em）590 nm，截止波长（Cutoff）570 nm。

仪器设置（吸光度模式）：使用吸光度酶标仪，推荐透明底微孔板，检测波长576 ± 5 nm。

试剂解冻：实验开始前，将所有试剂盒组分在室温下完全解冻。

储存建议：未使用的储备液建议分装成单次使用量，储存于-20°C，并避免反复冻融。

三、溶液配制指南

正确的溶液配制是保障实验结果准确性的前提。请严格遵循以下步骤：

1.NADPH标准品储备液（1 mM）制备：

向NADPH标准品（组分C）的小瓶中添加 200 µL 的 PBS 缓冲液，充分混匀，即得到浓度为 1 mM（1 nmol/µL） 的NADPH标准储备液。

2.梯度标准品制备（建议现配现用）：

取 10 µL 上述1 mM NADPH标准储备液，加入到 990 µL 的 PBS 缓冲液 中，混匀，得到 10 µM（10 pmol/µL） 的NADPH标准溶液（标记为最高浓度点）。

取该10 µM溶液，用PBS缓冲液进行 1:3 倍比稀释，依次制备得到系列梯度浓度标准品（NS7至NS1）。

注意：稀释后的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。可使用在线倍比稀释工具辅助计算。

3.NADP/NADPH工作液制备：

将 10 mL 的NADP/NADPH传感器缓冲液（组分B） 全部加入到含有 NADP/NADPH循环酶混合物（组分A） 的瓶中，充分混合均匀，即得到工作液。

注意：此工作液配制量足以用于 2块96孔板 的检测。该工作液不稳定，应现配现用，且严格避光保存。

四、简要操作流程

该试剂盒的操作流程极为简洁，概括如下：

1.加样：在微孔板中分别加入 50 µL 的NADPH梯度标准品或待测样品。

2.加工作液：每孔加入 50 µL 新配制的NADP/NADPH工作液。

3.孵育：在室温下避光孵育 15分钟至2小时。孵育时间可根据目标灵敏度进行灵活优化，时间越长信号强度越高。

4.读取：使用荧光酶标仪（Ex/Em = 540/590 nm）或吸光度酶标仪（576 ± 5 nm）读取信号值。

总结：

Amplite™ 荧光法总NADP/NADPH检测试剂盒（红色荧光）通过高特异性酶循环反应与红光检测技术的有机结合，成功解决了传统紫外法灵敏度低、干扰大的核心痛点。其“加样-孵育-读板”的超简流程、兼容荧光/吸光度双模式，以及完备的试剂组分，为研究脂质代谢，光合作用，氧化还原平衡以及药物靶向NADPH代谢的干预策略提供了一款即用型，高可靠性的高效工具。