武汉艾美捷科技有限公司

一、产品概述

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗RbBP5（视网膜母细胞瘤结合蛋白5）多克隆抗体（货号：A300-109A），经抗原亲和纯化，特异性识别人类和小鼠RbBP5蛋白。抗体适用于染色质免疫沉淀（ChIP）、ChIP-chip、ChIP-Seq、免疫细胞化学（ICC）、免疫组织化学（IHC）、免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB）等多种研究场景。抗体以未偶联（Unconjugated）的全IgG形式提供，浓度高达1000 µg/ml，保存于2–8°C条件下，有效期自收货之日起为1年。产品原产于美国，适用于表观遗传调控、组蛋白甲基化复合物及肿瘤抑制相关研究。

二、核心技术规格

参数项 | 具体规格

靶标 | RbBP5（视网膜母细胞瘤结合蛋白5）

反应种属 | 小鼠、人

适用实验 | ChIP、ChIP-chip、ChIP-Seq、ICC、IHC、IP、WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

抗体形式 | 全IgG

免疫原 | 人RbBP5蛋白488位至C末端（538位）区域

同种型 | IgG

偶联物 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原种属来源 | 人

浓度 | 1000 µg/ml

储存温度 | 2 – 8 °C

有效期 | 1年

缓冲液 | Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮化钠

表位信息：抗体识别的表位定位于人RbBP5蛋白第500位至C末端（第538位）之间的区域（参考序列NP_005048.2，GeneID 5929）。该C末端区域包含WD40重复结构域的一部分，远离与WDR5、ASH2L等核心复合物亚基的结合界面，确保免疫沉淀后仍可检测到完整的Set1样复合物。

三、产品制备与质量控制

3.1 纯化工艺

抗体采用抗原亲和纯化：将对应人RbBP5蛋白C末端区域（500–538位）的合成多肽或重组蛋白片段共价固定于固相支持物上，使兔免疫血清过柱，特异性IgG被吸附；经充分洗涤去除未结合蛋白后，以低pH缓冲液洗脱目标抗体，随后中和、透析并置换至含防腐剂的缓冲液中。

3.2 浓度测定

免疫球蛋白浓度通过比尔-朗伯定律确定：1 mg/ml纯化IgG在280 nm波长处的吸光度（A280）为1.4。本产品批次实测A280值经换算确保浓度为1000 µg/ml，批间一致性高。

3.3 纯度与特异性验证

抗原亲和纯化工艺可有效去除兔血清中的非特异性IgG及其他血清蛋白。经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估，抗体纯度典型值≥95%。功能性特异性通过以下方式验证：

在RbBP5敲除细胞裂解物中WB检测无信号

过表达RbBP5的细胞中信号显著增强

免疫沉淀后质谱鉴定确认仅富集RbBP5及其已知相互作用伙伴（如MLL家族、WDR5、ASH2L等）

四、推荐应用与稀释方案

以下用量和稀释范围为推荐起始值。由于不同实验体系存在差异，用户需根据预实验结果进行优化。

4.1 免疫印迹（Western Blot，WB）

推荐稀释范围：1:10,000 – 1:25,000

封闭与抗体稀释液：含5%脱脂奶粉的TBST（Tris缓冲盐+0.1% Tween-20）

一抗孵育条件：4°C 过夜（推荐）

推荐二抗：山羊抗兔IgG（重链+轻链）抗体，货号A120-101P

特殊注意事项：当对免疫沉淀产物进行WB检测时，建议使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体（轻链特异性），并在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清（货号S100-020），以避免重链交叉反应干扰。

阳性对照：HeLa、HEK293T或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）全细胞裂解液。RbBP5在多种细胞系中普遍表达。

4.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

推荐用量：6 µg 抗体 / mg 细胞裂解液总蛋白

裂解液选择：推荐使用温和非变性裂解液（如含150 mM NaCl、0.5% NP-40、50 mM Tris-HCl pH 7.4、蛋白酶抑制剂混合物）。为保留完整Set1样复合物，避免使用高浓度SDS或强变性剂。

孵育条件：裂解液与抗体4°C旋转孵育2–4小时或过夜，随后加入Protein A琼脂糖珠继续孵育1–2小时。

洗脱：可采用SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5分钟洗脱，或使用低pH甘氨酸缓冲液进行非变性洗脱。

阴性对照：使用同种型兔IgG（非免疫IgG）进行平行沉淀，以评估非特异性背景。

4.3 染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）

本抗体已有成功用于ChIP、ChIP-chip和ChIP-Seq的记录（参考文献：Dou et al., Nat Struct Mol Biol 13(8):713-719, 2006）。

ChIP类型 | 推荐用量 | 备注

ChIP（qPCR检测） | 1 – 3 µg / 反应 | 每个IP反应使用1–3 µg抗体

ChIP-chip | 10 µg / 反应 | 用于芯片杂交，需要较高抗体量

ChIP-Seq | 2 µg / 反应 | 用于高通量测序文库构建

4.4 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）

推荐稀释范围：1:500 – 1:2,000

抗原修复：推荐使用柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.0）进行热诱导抗原修复（微波或高压）

样本类型：福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片

检测系统：推荐使用聚合物标记的HRP二抗系统

阳性对照组织：小鼠或人睾丸组织（RbBP5在减数分裂细胞中高表达）、HeLa细胞蜡块

IHC操作提示：RbBP5定位于细胞核，呈弥散或斑点状分布。建议在封闭步骤中使用5%正常山羊血清阻断非特异性结合。

4.5 免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）

推荐稀释范围：1:250 – 1:1,000

样本类型：细胞爬片或培养细胞（4%多聚甲醛固定）

透化：0.5% Triton X-100处理10分钟

封闭：5%正常血清（来自二抗宿主）

检测：荧光标记二抗或HRP显色

储存稳定性

抗体于2–8°C运输和保存，请勿冷冻。反复冻融会导致抗体聚集和活性下降。若需长期保存，可分装后置于-80°C，但应避免反复冻融。

五、参考文献与应用支持

本抗体已成功应用于以下研究（参考已发表文献）：

Dou et al., Nat Struct Mol Biol 13(8):713-719, 2006（ChIP验证）

该研究证实RbBP5作为MLL复合物的核心成分，对H3K4甲基化和HOX基因表达至关重要。