武汉艾美捷科技有限公司

一、产品概述

本产品由艾美捷Bethyl Laboratories推出，是一款针对人RPA32（RPA2）蛋白第33位丝氨酸（Ser33）磷酸化形式的特异性兔多克隆抗体（货号：A300-246A），经抗原亲和纯化制备。该抗体经验证适用于蛋白质印迹（WB）检测，可特异性地识别细胞周期S期及DNA损伤应答中发生磷酸化的RPA32，仅供研究使用。

RPA（复制蛋白A）是一个异源三聚体复合物，由70 kDa（RPA1）、32 kDa（RPA2/RPA32）和14 kDa（RPA3）三个亚基组成。RPA在DNA复制、重组及修复中发挥核心作用，与MSH2、MLH1、PCNA及DNA聚合酶δ共同参与DNA错配修复。RPA32亚基在细胞进入S期时被cdc2家族激酶磷酸化，在DNA损伤时则被ATM、ATR及DNA-PK磷酸化。Ser33位点的磷酸化是RPA32激活的重要标志，广泛应用于细胞周期及DNA损伤应答研究。

二、产品规格

参数 详细信息

靶标 RPA32 磷酸化 (Ser33)

反应种属 人

应用 WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 完整IgG

免疫原 围绕丝氨酸33位的磷酸化合成肽

同种型 IgG

偶联物 未偶联

纯度 抗原亲和纯化

抗原种属 人

浓度 1000 µg/mL（1 mg/mL）

缓冲液 Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮化钠

储存条件 2–8°C

有效期 自收货之日起1年

三、靶标详细信息

3.1别名

REPA2， replication factor A protein 2， replication protein A 32 kDa subunit， replication protein A 34 kDa subunit， RF-A protein 2， RP-A p32， RP-A p34， RPA32。

3.3 功能背景

RPA是最重要的单链DNA结合蛋白复合物，其32 kDa亚基（RPA32）的磷酸化是调控DNA代谢的关键事件：

细胞周期依赖性磷酸化：当细胞进入S期时，cdc2家族激酶（如CDK2/cyclin E）磷酸化RPA32的Ser33和Ser29位点，促进DNA复制叉的建立。

DNA损伤应答磷酸化：在电离辐射、紫外线或化疗药物引起的DNA损伤时，ATM、ATR及DNA-PK激酶磷酸化RPA32的多个位点（包括Ser33），从而激活DNA修复通路并调控细胞周期检查点。

功能意义：磷酸化的RPA32增强RPA复合物与单链DNA的结合能力，并招募下游修复因子。Ser33位点的磷酸化被广泛用作DNA复制压力和基因毒性应激的生物标志物。

四、抗体制备与纯化

4.1 免疫原及表位定位

本抗体采用磷酸化合成肽作为免疫原。该肽段代表人RPA32蛋白中围绕第33位丝氨酸的氨基酸序列，该丝氨酸以磷酸化形式存在（参考序列NP_002937.1）。通过使用磷酸化抗原，免疫系统产生特异性识别磷酸化表位的抗体，而不识别非磷酸化形式的RPA32。

4.2 纯化方法

抗体通过抗原亲和层析纯化。将磷酸化合成肽固定于固相载体，使抗血清中的特异性IgG结合于该磷酸化表位，经洗脱获得高纯度抗体。此法确保最终产品中只保留识别RPA32 pSer33的抗体分子，显著降低与非磷酸化RPA32或其他磷酸化蛋白的交叉反应。

4.3 浓度测定

免疫球蛋白浓度采用比尔定律测定，以1 mg/mL IgG在280 nm下的吸光度（A280）为1.4作为标准。实测浓度为1000 µg/mL（1 mg/mL）。

4.4 缓冲液与防腐剂

抗体储存于Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 7–8），含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。注意：叠氮化钠有毒，操作时请佩戴防护手套。若用于需要叠氮化物敏感的细胞实验或动物注射，使用前应通过透析或超滤去除。

五、储存与稳定性

收到产品后，请将抗体置于2–8°C条件下储存。切勿冷冻，反复冻融会导致抗体变性聚集、效价下降。在推荐的储存条件下，自收货之日起1年内可保持稳定。由于本品为磷酸化特异性抗体，尤其应避免温度波动和反复冻融，建议分装后-20°C冻存（每份适量，避免多次解冻）。分装时使用低吸附管，并确保分装后立即冷冻。

六、常见问题（FAQ）

Q1：WB检测出现多条非特异性条带（如55 kDa、70 kDa），可能原因？  

A1：本抗体为磷酸化特异性多抗，高浓度下可能识别其他磷酸化蛋白。建议：①严格按照推荐稀释比1:20,000以上使用；②延长封闭时间或更换封闭液（5% BSA-TBST）；③使用高灵敏度ECL并缩短曝光时间。

Q2：未处理细胞中也出现较强的32 kDa信号，为什么？  

A2：部分细胞系（如HeLa、U2OS）在常规培养条件下由于内源性复制压力，RPA32 Ser33呈现基础水平的磷酸化。解决方法：①使用血清饥饿或接触抑制使细胞退出周期；②使用同步化至G1期的细胞作为阴性对照；③设置λ磷酸酶处理样本验证特异性。

Q3：DNA损伤处理后信号没有增强，可能原因？  

A3：检查以下几点：①损伤处理是否有效（建议设置平行样本检测γH2AX作为阳性对照）；②裂解液中是否添加了磷酸酶抑制剂；③抗体是否过期或反复冻融；④转膜效率是否正常（丽春红染色检查）；⑤一抗孵育是否过短（需4°C过夜）。

Q4：抗体能否用于免疫沉淀（IP）或免疫荧光（IF）？  

A4：本产品仅验证用于WB。用户可自行尝试IP，但由于磷酸化表位可能受IP条件影响，成功率不确定。不推荐用于IF，因为固定和透化过程中磷酸化信号可能丢失。

Q5：能否检测小鼠或大鼠的RPA32 Ser33磷酸化？  

A5：本抗体仅经验证针对人源蛋白。小鼠RPA32 Ser33在序列上不保守（人Ser33对应小鼠Ser31），不建议使用。如需鼠源检测，请联系技术支持。