武汉艾美捷科技有限公司

夹心法TR-FRET免疫检测法，用于细胞裂解液中磷酸化4EBP1（T37/T46）的半定量检测。完整的检测验证信息可在技术资料表中查阅。详细的检测操作步骤描述于通用用户手册中。检测性能的对比分析展示在更新后的应用说明书中。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET细胞信号检测试剂盒组分：

Eu-磷酸化4EBP1抗体（25 µL）

Acc-磷酸化4EBP1抗体（100 µL）

4EBP1对照裂解液（200 µL）

5倍浓缩裂解缓冲液2（5 mL）

10倍浓缩TR-FRET检测缓冲液（250 µL）

100倍浓缩磷酸酶抑制剂混合液（250 µL）

BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET细胞信号检测试剂盒(#KIT-4EBP1P-500)配套试剂：

THUNDER™ 4EBP1对照裂解液

THUNDER™裂解缓冲液2（5倍浓缩）

THUNDER™ TR-FRET检测缓冲液（10倍浓缩）

THUNDER™磷酸酶抑制剂混合液（100倍浓缩）

THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET细胞信号检测试剂盒检测原理：

磷酸化4EBP1（T37/T46）检测试剂盒是一种均相时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）夹心免疫检测法（见图1）。THUNDER™细胞信号传导检测工作流程包含3个步骤（见图2）。在细胞处理后，首先使用试剂盒中提供的特定裂解缓冲液将细胞裂解。然后，通过一对荧光标记的抗体以简单的“加入-孵育-测量”格式（单步试剂添加；无需洗涤步骤）检测细胞裂解液中的磷酸化4EBP1（T37/T46）。其中一个抗体标记有供体荧光团（铕螯合物；Eu-Ab1），另一个抗体标记有远红接受体荧光团（FRAb2）。两种标记抗体结合到目标蛋白上不同的表位，使两种染料靠近。使用闪光灯（320或340 nm）或激光（337 nm）激发供体铕螯合物分子时，会触发从供体到接受体分子的FRET，接受体分子随后在665 nm处发射TR-FRET信号。铕螯合物的剩余能量在615 nm处产生光。665 nm处的信号与细胞裂解液中磷酸化4EBP1（T37/T46）的浓度成正比。数据可以表示为665 nm处的信号，或665 nm/615 nm的比值。

图1：TR-FRET细胞信号测定原理的示意图。

图2：使用2板（转移）协议的检测工作流程。

试剂盒性能对比——与其他TR-FRET技术的比较

作为检测验证的一部分，THUNDER™磷酸化4EBP1（T37/T46）检测试剂盒与一种竞争性TR-FRET检测技术（公司A）进行了性能对比。具体而言，两种不同的检测方法在检测A431细胞经PP242处理后基础磷酸化4EBP1（T37/T46）抑制的能力上进行了并排比较，实验采用双板检测协议。所有试剂均按照各自制造商的推荐进行准备。细胞处理后，使用相应试剂盒的1X补充裂解缓冲液将细胞裂解。随后，裂解液在同一块384孔检测板上按照相应试剂盒的标准协议进行测试。在孵育4小时后，使用EnVision®（闪光灯激发）读取结果。数据显示，两种TR-FRET检测方法表现出相当的灵敏度（IC50值）和信背比（S/B）。

艾美捷科技是BioAuxilium的中国区域合作伙伴，为科研工作者提供优质的产品与服务。

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