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细胞内钙通量测定是一种广泛用于监测信号转导途径和高通量筛选G蛋白偶联受体（GPCRs）和钙通道靶标的的方法。自1989年Fluo-3被引入后，Fluo-4、Fluo-8和Cal-520随后被开发出来，它们具有改进的信号/背景比，成为共聚焦显微镜、流式细胞术和高通量筛选应用中广泛使用的Ca2+指示剂。然而，Fluo-4仍然存在一些严重问题。例如，与Fluo-3一样，在几乎所有使用Fluo-4 AM的细胞内钙测定中，都需要丙磺舒来防止细胞内加载的Fluo-4泄漏出细胞。使用丙磺舒进行基于Fluo-4的钙测定会妥协测定结果，因为丙磺舒被充分记录具有多种复杂的细胞效应。Calbryte™ 520 AM是一种新型的荧光且细胞可渗透的指示剂，用于测量细胞内钙。

 

与其他染料AM酯一样，AAT Bioquest-Calbryte™ 520 AM本身不荧光且不活跃。一旦Calbryte™ 520 AM进入细胞，它就会被细胞内的酯酶迅速水解，从而激活并对钙产生响应。激活后的指示剂现在是一个极性分子，无法自由通过细胞膜扩散，基本上将其困在细胞内。与钙离子结合时，Calbryte™ 520产生明亮的荧光信号，具有极高的信号/背景比。它具有与Fluo-4相同的激发和发射波长，因此相同的Fluo-4测定设置可以轻松应用于基于Calbryte™ 520的钙测定。其大大提高的信号/背景比和细胞内保留特性使Calbryte™ 520 AM成为评估GPCR和钙通道靶标以及筛选它们的激动剂和拮抗剂在活细胞中最强大的指示剂。

 

艾美捷AAT Bioquest-Calbryte 520 AM：

单位大小：10×50微克

目录编号：20650、20651、20653

解离常数(Kd, 纳摩尔)：1200

分子量：1090.90

溶剂：DMSO

激发(纳米)：493

发射(纳米)：515

量子产率：0.75

H-短语：H303, H313, H333

危害符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存条件：冷冻(< -15°C)；尽量减少光照暴露

UNSPSC：12352200

激发：488纳米激光

推荐板：黑色壁，透明底部

仪器规格：底部读取模式，可编程液体处理

准备库存溶液

除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在准备后分成单次使用的小份，并在-20°C下储存。避免反复冻融。

Calbryte™ 520 AM库存溶液：在无水DMSO中准备2到5毫摩尔的Calbryte™ 520 AM库存溶液。

注意：在DMSO中重悬时，Calbryte™ 520 AM是清澈无色的溶液。

 

图：使用Calbryte™520 AM（目录号20653）和Fluo-4，AM（目录编号20550）在CHO-K1细胞中测量ATP反应。将CHO-K1细胞以50000个细胞/100µL/孔的密度接种在96孔黑壁/透明底部肋板中过夜。将100µL 10µg/mL Calbryte™520 AM（含丙磺舒的HH缓冲液）或10µg/mL Fluo-4 AM（含丙磺舒的HH缓冲液）加入孔中，在37°C下孵育45分钟。去除两种染料负载溶液，并用200µL HH缓冲液/孔替换。加入ATP（50µL/孔）以达到10µM的最终指示浓度。在FITC通道的Keyence显微镜上采集图像。

 

工作溶液的准备：

Calbryte™ 520 AM工作溶液

在实验当天，将Calbryte™ 520 AM溶解在DMSO中或将指示剂库存溶液的小份量解冻至室温。

在您选择的缓冲液中（例如，Hanks和Hepes缓冲液）用0.04% Pluronic® F-127准备2到20微摩尔的Calbryte™ 520 AM工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用最终浓度为4-5微摩尔的Calbryte™ 520 AM。细胞加载所需的指示剂确切浓度必须通过实验确定。

注意：非离子洗涤剂Pluronic® F-127有时被用来增加Calbryte™ 520 AM的水溶性。可以从AAT Bioquest购买各种Pluronic® F-127溶液。

注意：如果您的细胞包含有机阴离子转运体，可以在染料工作溶液中加入丙磺舒（1-2毫摩尔），以减少脱酯化指示剂的泄漏（最终井中浓度将为0.5-1毫摩尔）。可以从AAT Bioquest购买各种ReadiUse™丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液。

 

样品实验协议

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的协议。此协议仅提供指导，并应根据具体需要进行修改。

在生长介质中准备细胞过夜。

第二天，将1X Calbryte™ 520 AM工作溶液添加到您的细胞板中。

注意：如果您的化合物与血清发生干扰，在染料加载前用新鲜的HHBS缓冲液替换生长介质。

将染料加载板在37°C的细胞培养箱中孵育30至60分钟。

注意：将染料孵育超过1小时可以提高某些细胞系的信号强度。

用HHBS或您选择的缓冲液（如果适用，包含阴离子转运体抑制剂，如1毫摩尔丙磺舒）替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

根据需要添加刺激剂，并同时使用配备FITC滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统的荧光板读取器（如FDSS、FLIPR或FlexStation）测量荧光，Ex/Em = 490/525纳米截止515纳米。

 

AAT Bioquest-Calbryte 520 AM文献参考：

Calreticulin regulates TGF-β1-induced epithelial mesenchymal transition through modulating Smad signaling and calcium signaling

Authors: Wu, Yanjiao and Xu, Xiaoli and Ma, Lunkun and Yi, Qian and Sun, Weichao and Tang, Liling

Journal: The International Journal of Biochemistry & Cell Biology (2017)

Monosialoganglioside 1 may alleviate neurotoxicity induced by propofol combined with remifentanil in neural stem cells

Authors: Lu, Jiang and Yao, Xue-qin and Luo, Xin and Wang, Yu and Chung, Sookja Kim and Tang, He-xin and Cheung, Chi Wai and Wang, Xian-yu and Meng, Chen and Li, Qing and others, undefined

Journal: Neural Regeneration Research (2017): 945

Obtaining spontaneously beating cardiomyocyte-like cells from adipose-derived stromal vascular fractions cultured on enzyme-crosslinked gelatin hydrogels

Authors: Yang, Gang and Xiao, Zhenghua and Ren, Xiaomei and Long, Haiyan and Ma, Kunlong and Qian, Hong and Guo, Yingqiang

Journal: Scientific Reports (2017): 41781

Dexmedetomidine reduces hypoxia/reoxygenation injury by regulating mitochondrial fission in rat hippocampal neurons

Authors: Liu, Jia and Du, Qing and Zhu, He and Li, Yu and Liu, Maodong and Yu, Shoushui and Wang, Shilei

Journal: Int J Clin Exp Med (2017): 6861--6868

The effect of mitochondrial calcium uniporter on mitochondrial fission in hippocampus cells ischemia/reperfusion injury

Authors: Zhao, Lantao and Li, Shuhong and Wang, Shilei and Yu, Ning and Liu, Jia

Journal: Biochemical and biophysical research communications (2015): 537--542

 

艾美捷科技是AAT Bioquest的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

 

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