武汉艾美捷科技有限公司

蛋白质-DNA相互作用在基因表达调控、基因组完整性和染色质组织中扮演着至关重要的角色。染色质免疫沉淀（ChIP）是一种常用于检测蛋白质与DNA之间相互作用的技术，它基于与感兴趣蛋白相关的DNA的富集。但是经典的ChIP方法需要甲醛固定起始材料，交联后，还需要对细胞裂解液进行超声分离染色质，繁杂冗长的操作使得ChIP存在很大的局限性。尽管后来出现的定向切割和核酸酶释放（CUT&RUN）技术解决了部分问题，但是CUT&RUN技术是在未固定的完整细胞或核上原位进行的，需要通过蛋白AG-微球菌核酸酶（pAG-MNase）融合蛋白在特定抗体占据的位点切割染色质，并随后释放蛋白/DNA复合物，使用的pAG-MNase融合蛋白可能会产生由未偶联抗体的pAG-MNase引起的非特异性切割，这显著限制了CUT&RUN在不同物种和细胞/组织类型中大多数转录因子的使用特异性。

艾美捷EpiNext CUT&LUNCH蛋白/DNA复合物富集试剂盒（#P-2035-24）：

组分 中文名称 体积 保存条件

WB (Wash Buffer) 洗涤缓冲液 30 ml 4℃

PB (Permeabilization Buffer) 破膜剂(通透缓冲液) 4 ml RT

PIC(Protease Inhibitor Cocktail)* 蛋白酶抑制剂混合物* 30 μl 4℃

NDE (Nuclear Digestion Enhancer) 核消化增强剂 300  μl RT

CEM (Cleavage Enzyme Mix)* 切割酶混合物* 60  μl -20℃

Positive Control Ab (H3K4me3,1 mg/ml)* 阳性对照抗体(H3K4me3,1 mg/ml)* 8μl -20℃

Non-Immune lgG (1 mg/ml)* 非免疫lgG(1 mg/ml)* 25μ 4℃

CSS (Cleavage Stop Solution) 切割终止液 30 μl RT

PDB(Protein Digestion Buffer) 蛋白消化缓冲液 5ml RT

Proteinase K(10 mg/ml)* 蛋白酶K(10 mg/ml)* 100 μl 4℃

Affinity Beads 亲和珠 100 μl 4℃

DPS(DNA Purification Solution) DNA纯化溶液 600 μl RT

DNA Binding Beads DNA结合珠 60  μ 4℃

Elution Buffer 洗脱缓冲液 1 ml RT

*在开盖使用之前，将溶液离心至管底。

自备材料：

设备 ：

漩涡混合器

显微镜和细胞计数器

带有48孔或96孔模块的热循环仪

离心机，包括台式离心机(最高转速可达14,000转/分钟)

旋转器或滚动摇床

磁力设备(96孔PCR 板格式)

可调移液器和移液器吸头

0.2毫升 PCR 管

1.5毫升微量离心管

试剂：

PBS (磷酸盐缓冲液)

感兴趣的抗体

细胞样本

100%乙醇

100%异丙醇 蒸馏水

原理与步骤：

EpiNextTM   CUT&LUNCH检测试剂盒包含了富集特定蛋白(组蛋白或强结合转录因子)-DNA 复合物所需 的所有必要试剂，以便通过qPCR 或 NGS 从各种细胞样本中分析蛋白质与DNA  之间的相互作用。在这个 检测中，细胞被渗透并暴露于感兴趣的 ChIP 级抗体。使用一种独特的核酸切割酶混合物，目标染色质区域 两端的DNA 序列被切割/移除。释放的非特异性蛋白-DNA 复合物被消除，只有与抗体结合的复合物将被 选择性回收。捕获的蛋白/DNA 复合物中的DNA 片段被纯化，可以直接用于基因特异性qPCR 或DNA 文 库构建，以分析蛋白质与DNA 之间的相互作用。

实验步骤：

步骤与所需时间：

1.抗体与目标结合   所需时间30分钟

2.酶切割   所需时间10分钟

3.选择性回收和纯化   所需时间60分钟

https://www.amyjet.com/products/P-2035-24.shtml