麦克林蛋白质印迹法详解

发布人：上海麦克林生化科技股份有限公司

发布日期:2023/11/23 14:42:52

Western印迹法（Western blot）或称“蛋白质转渍法”、“免疫印迹法”（immunoblot）或“西式吸印杂交”，是在分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

利用特定抗体能够专一结合其抗原蛋白质的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息，来分析检测特定蛋白质的生物学检测技术。

西方点墨法使用抗体识别修改的硫辛酸蛋白

麦克林提供各类蛋白质印迹法实验试剂供科研人员选择。

麦克林蛋白质印迹法实验试剂具有纯度等级高、生产工艺先进、接受研发定制等特点，能被广泛适用于各类科研项目、研究实验中，欢迎选购。

本文通过以下几点阐述麦克林蛋白质免疫印迹试剂的种类、反应原理及性质：

1、原理

2、实验步骤

3、分类

4、麦克林蛋白质免疫印迹相关试剂产品介绍

原理

蛋白质免疫印迹法与Southern或Northern杂交方法类似，但免疫印迹法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（根据分子大小）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤

实验大致分为铸胶、跑胶、转渍、接一级抗体、接二级抗体以及压片几个部分。

1、组织准备

样本可以从整个组织或者细胞培养物中获得。固体组织首先需要被机械性的破碎，可以使用搅拌器（对于较大体积的样本），匀质机（对于小体积的样本），或者利用超声波粉碎。细胞也可以通过上述方式机械性的被破开。当然病毒及环境样本也可以是蛋白的来源，因此蛋白质免疫印迹法并不仅限于细胞研究。

合适的清洁剂、盐类和Buffer都可以被用于裂解细胞以及溶解蛋白。蛋白酶和磷酸酶抑制剂经常被添加进去，以防护样品被其自身的酶消化掉。组织准备经常在低温条件下进行，以避免蛋白变性和降解。

生物化学与机械技术（包括各种形式的过滤和离心）的结合，可用于分离不同的细胞室与细胞器。

2、凝胶电泳

样本中的蛋白质通过凝胶电泳进行分离。蛋白质可以通过等电点（pl），分子量，电荷，以及上述因素的组合进行分离。分离的实际效果取决于样本的处理和凝胶的性质。这是用来识别某种蛋白的一个非常有用的方法。

最常见的凝胶电泳方式是采用聚丙烯酰胺凝胶和十二烷基硫酸钠(SDS)作为缓冲负载的组合。SDS-PAGE（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）能够保存处在变性状态下的多肽，这些多肽由蛋白质被强还原剂还原而失去了二三级结构产生（例：从二硫键[S-S]到巯基[SH and SH]），通过他们不同的分子量，从而将蛋白质分离。采样蛋白被带负电荷的SDS包裹，并通过凝胶的丙烯酰胺网格移动到带正电的电荷上。较小的蛋白质会更快的迁移通过这个网格，因此蛋白质是通过大小（通常用千道尔顿，kDa作为量度单位）进行分离的。丙烯酰胺浓度决定了凝胶的分辨率：丙烯酰胺浓度越大，较低分子量的蛋白质的分辨率越好。丙烯酰胺浓度越低，高分子量的蛋白质的分辨率越好。蛋白质通常在凝胶上只沿一维做线性运动形成印痕。

样品被加载到凝胶的泉点。第一道通常是预留给标记物或者梯度物的，它们是一些市售的蛋白质混合物，具有标定的分子量，能形成典型可见的彩色染色条带。当电压被施加在凝胶上，蛋白质透过其以不同的速度进行迁移，取决于蛋白质的大小。这些不同的前进速率（不同的电泳迁移率）在每个道内单独形成条带。

它也可以使用两维（2-D）的凝胶，蛋白质从一个单一样品中沿两个维度传播。蛋白质按等电点（蛋白质解离成阴阳离子的趋势或程度相同，使得净电荷成中性，此时的pH值即为等电点）在第一个维度分离，并根据其分子量在第二个维度中分离。

3、转渍

要让抗体成功对蛋白质产生反应，就要将蛋白质从凝胶中转移到用硝化纤维或聚偏二氟乙烯（PVDF）制成的膜。转渍蛋白质时，最常用的方法称为"电印迹"(Electroblotting)，即运用电流，从凝胶中牵引出带负电荷的蛋白质，使其向带正电荷的阳极方向移动，进入PVDF或硝化纤维膜内。蛋白质自凝胶移入膜内时，可维持其在凝胶内形成的结构。较旧的转渍方法，则是在凝胶上先放一块膜，再放一叠滤纸，然后，将其整叠移至缓冲溶液中，溶液在毛细管作用下会带动蛋白质，一同由下而上进入滤纸。但实际上由于耗时长，该方法并不常用。不论采用何种方法，转渍完成后，蛋白质便会显露于薄膜上，可供检测。

4、封闭

由于膜能结合蛋白质，所以抗体以及目标蛋白都可以结合到膜上，也因此我们必须防止膜和抗体的反应发生。把膜放在稀释的蛋白质溶液中（比如3-5%的牛血清蛋白、脱脂牛奶、TBS或者I-Block）可以阻挡非特定的结合。稀释溶液中的蛋白会把膜上没有与目标蛋白结合的地方全部结合，因此加了抗体之后，膜上就没有空间去结合其他非目标蛋白。阻拦是实验最后的铺垫，可以使结果更清晰，排除错误可能性。

5、检测

在检测过程中，使用被修饰的抗体作“探针”来标记膜上的目标蛋白，这一抗体与报告酶相连接。当暴露于适当的底物时，报告酶驱动比色反应并产生颜色。由于各种原因，这传统上发生在一个两步法的过程中，虽然现在某些应用中可以用一步法的检测方法。