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为探讨猫爪草不同提取物对体外培养的肿瘤细胞的作用，采用系统溶剂法提取猫爪草皂苷及多糖，运用MTT和集落形成实验法观察不同浓度的皂苷及多糖对体外培养的肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7的影响。结果发现猫爪草皂苷及多糖对三种肿瘤细胞株的生长和集落形成均有不同程度的影响，皂苷给药量与抑瘤率和集落形成明显地呈正相关关系，而多糖有一浓度。

关键词 猫爪草;皂苷;多糖;体外抗肿瘤;MTT法

猫爪草Radix ranunculus ternati系毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根,具散结、消肿之功，可用于治疗瘰疬、淋巴结核未溃、肺结核、淋巴结炎、咽喉炎、疖病、肿瘤等疾病[1,2]。经多年临床验证，猫爪草对恶性淋巴瘤、甲状腺瘤和乳腺肿瘤等具有较好的效果[3,4]，但有关猫爪草抗肿瘤的有效成分及作用机制尚不清楚。鉴于猫爪草入药常以水煎煮用之，且经初步预试，猫爪草中皂苷及多糖含量较高。为此本实验采用系统溶剂提取法对猫爪草皂苷及多糖进行提取，研究其对体外培养的肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7的作用，以寻找猫爪草抗肿瘤的有效部位及作用机理，为临床治疗肿瘤提供理论依据。

1、材料

1.1药材
猫爪草，购自济南市建联药店，产地为河南信阳，经姚廷芝主任药师鉴定为毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根。5-氟脲嘧啶(上海制药十二厂提供，批号20020125)。
 

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图片
1.2细胞株
肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7均由山东中医药大学肿瘤研究中心提供。

1.3试剂
RPMI-1640培养液(美国Gibco产品)、FCS(小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品)、MTT(Sigma公司产品)、D-Hanks液、DMSO(二甲基亚砜)、乙醇、乙醚、正丁醇等。
 

1.4仪器
CO2恒温培养箱(日本三洋公司)、超净工作台、倒置显微镜、酶联免疫仪( Thermo Labsystems)、离心机、培养瓶、96孔培养板、液氮罐等，冷冻干燥机(北京博医康技术公司)

2、方法

2.1猫爪草皂苷及多糖提取物的制备
参考文献方法[5，6]精密称取干燥的猫爪草100g，粉碎成粗颗粒，置索氏提取器中，用95%乙醇提取6h，醇提液回收乙醇，用乙醚萃取2次，再以水饱和的正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液用0.1mol/LNaoH萃取2次，正丁醇液回收至干，得总皂苷。醇提液残渣，加水煎煮2次，时间分别为2h、1h，合并水煎液，浓缩、离心去沉淀。上清液加入4倍95%乙醇，4℃冰箱中冷置24h，离心，收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白、透析、冷冻干燥得总多糖。将所得皂苷和多糖用蒸馏水溶解，定容至1g生药/mL，G6漏斗滤过除菌，4℃冰箱内保存备用。

2.2 MTT法测定细胞增殖的抑制率[7]
采用RPMI-1640培养液，含青霉素10万U/L、链霉素10万U/L、10%新生小牛血清(FCS，56℃灭活30min)缓冲液调pH至约7.2，将待测细胞株配成单个细胞悬液。取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后，用培养液稀释至浓度4~5×104/mL，接种于96孔板，每孔加入190μL。同时设溶剂对照，每个剂量设3个平行孔，常规培养24h后，加入不同剂量的受试药物，在37℃饱和湿度、5%C02培养箱中培养72h，后，每孔加入MTT溶液(用生理盐水配制)10μL(5mg/mL)，震荡混匀后，继续培养4h。吸去上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，轻轻振荡，约1h后，用酶标仪在570nm波长处测其OD值，计算抑制率，求IC50，测定时减去空白对照。按下列公式计算细胞毒性：细胞毒性=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)x100%。

2.3集落形成实验[8]
将待测细胞株以100个细胞/皿分别接种于10mL37℃预温培养液的培养皿中，常规培养24h后，加入受试药物，在37℃饱和湿度、5%CO2培养箱中培养10d，弃去培养液，用PBS(0. 01mol/L，pH至约7.4)小心浸洗3遍，10%甲醇固定，15min后弃去固定液，0.25%龙胆紫染色。显微镜计数大于50个细胞的克隆数，对照组以培养液代替受试药物，结果以克隆形成率(%)表示(克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%)。

3、结果与分析

3.1猫爪草皂苷及多糖提取物不同剂量对S180、EAC、MCF-7不同肿瘤细胞株的杀伤作用，见表1。

表1结果显示，三个实验剂量组的猫爪草皂苷和多糖对肉瘤S18o、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7的生长均有不同程度的抑制作用，各剂量组与阴性对照组比较均有显著性的差异。猫爪草皂苷给药量与抑瘤率明显地呈正相关关系，而多糖在给药量0.10mg/mL时，抑瘤效果，过高或过低都会影响实验结果。从直观分析可以看出，皂苷比多糖抑瘤效果好。

3.2猫爪草皂苷及多糖提取物不同剂量对S180、EAC 、MCF-7不同肿瘤细胞株集落形成的影响，见表2。

表2结果显示，猫爪草皂苷三个实验剂量组对三种肿瘤细胞株的集落形成均有不同程度的影响，各剂量组与阴性对照组比较均有显著性的差异。而多糖在给药剂量0.10-10.20mg/mL，时影响明显，剂量过低几无影响。

4、讨论

猫爪草在临床上具有确切的抗肿瘤效果，有关其抗肿瘤的机制，曾有人从微量元素与健康的角度认为，癌症患者血清中Cu/Zn值升高，而猫爪草Cu/Zn值趋向与癌症患者Cu/Zn相反，因此可能有助于调节患者体内Cu、Zn平衡而发挥抗癌效果[9]；另有研究认为，猫爪草70%的乙醇浸膏对瘤坏死因子(TNF)具有较强的诱生作用[10]，其他尚未见有报道。本实验根据化学成分预试的结果，对其含量较高的两种主要提取物进行了体外抗肿瘤作用的初步研究。结果显示，猫爪草皂苷及多糖对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7的三种肿瘤细胞株的生长和集落形成均有不同程度的影响，与阴性对照组比较有显著性的差异；皂苷比多糖抑瘤效果好，皂苷给药剂量与抑瘤率和集落形成明显地呈正相关关系，而多糖有一剂量。本研究不仅为寻找猫爪草抗肿瘤的有效部位奠定了基础，也为猫爪草治疗肿瘤的机理提供了理论依据。

皂苷和多糖是广泛存在于植物界的两大类复杂的化合物，其分离分析一直是比较活跃的研究领域。诸多研究表明，皂苷类有效成分在免疫调节、抗肿瘤、护心、护脑、延缓衰老及对心脑血管、中枢神经系统、消化系统、造血系统等方面发挥了越来越重要的作用[11]；而多糖作为一种重要的免疫调节剂，生物学特性更广泛，如抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等[12]。本实验证实猫爪草皂苷及多糖体外均有抗肿瘤作用，而其抗肿瘤确切的有效成分及结构和功能的关系还有待深入探讨，我们正在进一步研究中。

【药品名称】猫爪草胶囊

【成份】猫爪草。

【性状】本品为胶囊剂，内容物为棕褐色光滑小丸粒；气微，味微酸。

【功能主治】散结，消肿。用于瘰疬，淋巴结核未溃者，亦可用于肺结核。

【规格】每粒装0.53g。

【用法用量】口服，一次4-6粒，一日3次，黄酒送服。连服六日，隔三日后再服。老人及儿童酌减。（儿童用快接健冲温开水送服，3至4岁一次1粒，5至8岁一次2粒，9至12岁一次3粒，每日3次；女士避开经期。）

【不良反应】尚不明确。

【禁忌】尚不明确。

【猫爪草适应症】乳腺增生，子宫肌瘤，前列腺炎、增生、肥大，甲状腺结节，囊肿，淋巴结肿大，肿瘤，结核，宫颈糜烂，糖尿病，痛风，顽固性牙痛，偏头痛，肝病等。

参考文献

1、中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典，一部.北京：化学工业出版社，2000.260.

2、金山丛.中药猫爪草的研究概况.中药材，1993，16(11)：36-38.

3、周维顺，吴良村.恶性淋巴瘤证治述要.浙江中医杂志，1997，32(8)：345.

4、杨今祥.抗癌中草药制剂.北京：人民卫生出版社，1981.173.

5、周跃华，徐德生，冯怡，等.麦冬总皂苷提取工艺的研究.中草药，2002，23(12)：1076-1078.

6、中国科学院上海药物研究所.中草药有效成分提取与分离第二版.上海：上海科学技术出版社，1983.

7、Twentyman PR. A study of some variables in a tetrazolium dye(MTT) based assay for cell growth and chemose-sitivity. Br J Cancer，1987，56： 279.

8、Svegliati BG，et al. The Na+ /H+ exchanger modu-lates the fibrogenic effect of oxidative stress in rat hepatic satel-late cells. Jhepatol，1999，30 (5)： 868.

9、全山丛，汪学昭，郑汉臣，等.中药猫爪草的微量元素分析.微量元素与健康研究，1997，14(2)：29-30.

10、周立，张炜，许津.猫爪草有效成分诱生肿瘤坏死因子的作用.中国医学科学院学报，1995，17（6）：456-460.

11、樊永蓉，廖庆文.中草药中皂苷类有效成分药理作用研究现状.湖南中医药导报，2003，9(11）：52-53.

12、曹锦花，李华，多糖类免疫调节剂的研究进展.中国生化药物杂志，1999，20(2)：104-106.

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