西尼罗病毒（WNV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（冻干型）

【产品名称】

商品名称：西尼罗病毒（WNV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（冻干型）

Name：Peste des Petits Ruminants Virus Detection Kit(Real-Time PCR Method)(Lyophilised)

【包装规格】48 人份/盒

【预期用途】

西尼罗河病毒（WestNile virus，WNV）是一种不分节段的单股正链 RNA 病毒，属于黄病毒科黄病毒属， 可引起人畜共患疾病。该病毒最早发现于乌干达，由于在西尼罗河地区分离得到，故而得名。该病毒的主要传 染源为野生鸟类，传播媒介为库蚊。病毒在鸟类体内高浓度循环，产生病毒血症，使大批蚊子感染，然后通过 蚊子U咬传播给鸟，人类和某些哺乳动物，且前对于WNV感染临床诊断主要采用血清学和病毒学方法进行检测 血清学检测由于 WNV 与日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）等存在交叉反应，降低了临床诊断的 准确性。病毒学主要采用病毒培养法，准确性较高，但时效性低。近年来随着分子生物学技术的不断发展，实 时荧光定量 PCR 逐渐被应用于临床诊断。

本试剂盒适用于检测的疑似感染动物或人的静脉血等标本中西尼罗河病毒 RNA，适用于西尼罗河病毒感染 的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对西尼罗河病毒特异性引物，结合一条特异性探 针，用荧光 PCR 技术对西尼罗河病毒的 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

WNV 反应体系为冻干粉，含有荧光 PCR 所需的 Taq酶、反转录酶、引物、探针、dNTPs、Mg2+等所有 组分。

阳性质控品添加 100μL 复溶剂，混匀，使用掌上离心机瞬时离心即可使用

【储存条件及有效期】

常温条件下保存，有效期为 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

疑似感染动物或人的静脉血 2mL至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2^∘C ∼ 8^∘C条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置 .70^∘C 以下保存，冻融不 超过 3 次。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

采用商品化试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2 核酸提取

推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，

请按照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

复溶剂瞬时离心，每瓶干粉加入 960μL 复溶剂，震荡混匀后使用。注：反应体系开盖前，确认冻干粉位于 瓶底。

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM、VIC， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿 选择 ROX 参比荧光，选择None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实 际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的 扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2 结果判断

FAM 通道为西尼罗病毒检测结果，VIC 通道为人内源性基因检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3 质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6. 检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。