上海臻科生物科技有限公司

甲硝唑快速检测试剂盒

（血液）使用说明书

【原理】

本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被抗 甲硝唑抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，甲硝唑抗体及酶标记物，包被抗原和加入样本中的甲硝唑竞争性地与甲硝唑抗体结合后，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色；加入反应终止液，在450nm波长酶标仪下进行检测，样品中的甲硝唑浓度与吸收光强度成反比。

【适用范围】

本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出肌肉、肝脏等中的甲硝唑类药物。

【【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.1ppb

检测时间：45min

样本定量检测下限：  

血   液………………………………………2ppb

样本回收率

血   液…………………………………80±15%

交叉反应率

甲硝唑………………………………………………100%

【试剂盒组成】   

1、 微量测试孔：（1X96孔板）每条8孔，一板12条

2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高浓度标准品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶标记物         7ml…………………………红色帽

5、 抗体工作液     7ml…………………………绿色帽

6、 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

7、 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

8、 终 止 液          7ml…………………………黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40ml…………………… 白色帽

10、 2X浓缩复溶液50 ml      ………………… 蓝色帽

【所用仪器、试剂】   

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

试         剂：去离子水

【实验前溶液配制】

样本处理前需配制：

配液1、1×复溶液：

                将2×浓缩复溶液用去离子水以1：1稀释（1份1×浓缩复溶液+1份去离子水），用于样本提取和稀释。

配液2、将40ml浓缩洗涤液（10倍浓缩）用去离子水按照 1：9稀释（1份浓缩洗涤液+9份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

【样本前处理方法】   

样本前处理步骤

（a）血液样本的处理

1、取出50μL血液+450μL的1×复溶液液混合30s；

2、取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：10倍 

【酶标免疫分析程序】   

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置

4、 加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入酶标记物50µl/孔后再加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔吸光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与甲硝唑的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.610；0.1ppb为1.350；0.3ppb为1.030；0.9ppb为0.660；2.7ppb为0.379；8.1ppb为0.198。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb； 样本2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中甲硝唑的实际含量。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以甲硝唑标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中甲硝唑实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

                  0.1                 0.3               0.9                2.7               8.1                                               甲硝唑(ppb) 

图1：甲硝唑检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

       0      0.1       0.3      0.9     2.7     8.1

甲硝唑(ppb) [µg/kg]

图2：甲硝唑检测试剂盒的精密度

  由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出甲硝唑检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应甲硝唑浓度作曲线，可以看到全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】   

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。