上海臻科生物科技有限公司

                       氨苄青霉素酶联免疫检测试剂盒

（药品）使用说明书

【测定原理】

       本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被抗氨苄青霉素抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，氨苄青霉素受体和抗体以及酶标记物，包被抗原和加入样本中的氨苄青霉素药物竞争性地与氨苄青霉素受体抗体结合后，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色；加入反应终止液，在450nm波长酶标仪下进行检测，样品中的氨苄青霉素浓度与吸收光强度成反比。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.1ppb

检测时间： 75分钟

样本检测下限：

药品 …………………………………………4ppb

细胞培养液……………………………………6ppb

样本回收率

药品……………………………… 65%—125%

细胞培养液………………………… 65%—125%

反应率

氨苄青霉素…………………………………100%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 酶标记物       7ml………………………红色帽

4、 200×浓缩受体 50ul……………………离心管

5、 抗体工作液   7ml ………………………红色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

8、 终  止  液     7ml  …………………… 黄色帽

9、 10×浓缩洗涤液40 ml  ……………… 白色帽

10、 2× 浓缩复溶液  50ml ·………………   蓝色帽

11、 盖板膜……………………………………1张

12、 说明书 ……………………………………1份

【所用仪器、试剂】   

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、

振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl

（2）试剂（高检测限处理方法时使用）：乙腈、正己烷、氯化钠

【实验前溶液配制】

配液1、1×复溶液：

                将2×浓缩复溶液用去离子水以1：1稀释（1ml浓缩复溶液+1ml去离子水），用于样本提取和稀释。

配液2、1×洗涤液

将40ml（10×浓缩洗涤液浓缩）用去离子水按照1：9稀释（1ml浓缩洗涤液+9ml去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

配液3 、受体工作液的配制：

取5ul的200X浓缩受体，加入1000ul配制好的1×复溶液混匀即可，或按所需用量配制抗体。

【样本前处理步骤】

样本处理前须知：处理任何样本时，都必须注意：

（1）实验中须使用一次性吸头，吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（A）药品（颗粒、片剂、粉剂）样本处理方法

（样本稀释倍数：40倍;检测限4ppb）

1、 称取1±0.05g待检粉碎药品于10 ml离心管中，分别加入2ml去离子水和2ml甲醇旋涡震荡3分钟；在离心机3000g以上，室温离心3min；

2、 取50µl上清液，加入450µl  的1×复溶液混匀，混合30s；

3、 取50µl用于分析。

样本稀释倍数：40

（c）细胞培养液

（样本稀释倍数：20倍;检测限6ppb）

1、取1ml细胞培养液于离心管中，在3000r/min，4℃离心10min，去除上层脂肪。

2、取50µl上清液，加入950µl 稀释后的复溶液混匀，混合30s

3、取50µl液体用于分析。

【酶联免疫检测步骤】

1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加配制好的受体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、取出将孔内液体甩干，用配好的1×洗涤液250µl /孔，洗板5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、加入抗体工作液50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

7、取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、显色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

9、测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】 

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含氨苄青霉素成负相关

1、粗略判定

 用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.510；0.1ppb为1.320；0.3ppb为1.030；0.9ppb为0.660； 2.7ppb为0.389；8.1ppb为0.198。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb； 样本2的浓度范围是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中氨苄青霉素实际浓度。

2、定量分析：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以氨苄氨苄青霉素啉标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氨苄氨苄青霉素啉实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

         0.1        0.3         0.9        2.7       8.1

氨苄青霉素(ppb) [µg/kg]

              图1：氨苄青霉素检测试剂盒的回归曲线

4、再现性

%CV 

            0       0.1     0.3     0.9     2.7    8.1

 (ppb) [µg/kg]

氨苄青霉素(ppb) [µg/kg]

      图2：氨苄青霉素检测试剂盒的精密度

  由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出氨苄青霉素检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应氨苄青霉素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数均小于5%；可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】有效期12个月;生产日期、有效期、批号见外包装。