上海臻科生物科技有限公司

                               氢化可的松酶联免疫检测试剂盒

                                                    使用说明书

【适用范围】

适用于动物组织、奶类样品中氢化可的松残留快速筛查检测。

【测定原理】

        本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物氢化可的松将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氢化可的松抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物氢化可的松的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物氢化可的松的含量。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.1ppb

检测时间： 45分钟

样本检测下限：

生鲜奶……………………………………………6ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………0.3ppb

动物组织………………………………………0.3ppb

交叉反应率：

氢化可的松……………………………………100%

样本回收率：

生鲜奶…………………………………85%±10%

奶粉、奶油、奶酪……………………85%±15%

组  织…………………………………85%±15%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 酶标记物      7ml……………………… 红色帽

4、 抗体工作液  7ml……………………… 绿色帽

5、 底物A液     7ml  ……………………棕色帽

6、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

7、 终  止  液     7ml  ……………………黄色帽

8、 2×浓缩复溶液  50ml ·………………  蓝色帽

9、 10×浓缩洗涤液40 ml  ………………白色帽

10、 盖板膜……………………………………1张

【 所用仪器、试剂】

具备的仪器：微孔酶标仪、氮气吹干装置、打印机、均质器 、振荡器、离心机、恒温箱、天平（感量0.0g）、刻度移液管

微量移液器：单道20µL-200µL、100µL-1000µL、多道 250µL

试          剂： 乙腈、正己烷、氯化钠、去离子水（蒸馏水或超纯水）

【实验前溶液配制】

配液1、1×复溶液：

                将2×浓缩复溶液用去离子水以1：1稀释（1ml浓缩复溶液+1ml去离子水），用于样本提取和稀释。

配液2、1×洗涤液

将40ml（10×浓缩洗涤液浓缩）用去离子水按照1：9稀释（1ml浓缩洗涤液+9ml去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】

样本处理前须知：处理任何样本时，都必须注意：

（1）实验中须使用一次性吸头，吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）生鲜奶；（样本稀释倍数：20倍）

     1、直接取50µL牛奶+950µL配好的1×复溶液混合30s；

     2、取50µL用于检测检测分析。

（b）奶粉、奶油、奶酪（样本稀释倍数：1倍）

1、称取3g样品于50ml离心管中，加入6ml乙腈，强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml配好的1×复溶液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，

4、取50ul下层溶液进行检测分析。

（c）动物组织（样本稀释倍数：1倍）

1、用均质器均质样本；称取3±0.05g样本于50ml离心管中，加入1g氯化钠，再加入6ml乙腈，用振荡器振荡5分钟；4000转/分以上,室温离心5分钟；

2、取上清液2ml至干净试管中，于65℃水浴下氮气/空气吹干；

3、加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml配好的1×复溶液强烈振荡混合30s，室温4000r/min以上离心3分钟。

4、取50 µl下层清亮液体用于分析。

【酶标免疫分析程序】

操作步骤：

1、 将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30分钟以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加样：加标准品/样本50µL/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µL/孔，再加入抗体工作液50µL/孔。用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃环境中反应30分钟。

5、 洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用1×洗涤液250µL/孔充分反复洗涤5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物A液50µL，再加底物B液50µL，轻轻振荡混匀25℃环境避光显色15分钟。

7、 终止：每孔加入终止液50µL，轻轻振荡混匀，

8、 测定：设定酶标仪于450nm处 （建议用双波长450/630nm，检测在5分钟内读完数据）测定每孔OD值。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含氢化可的松量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。例如样本1的吸光度值为0.351，样本2的吸光度值为0.755，标准品吸光度值分别是： 0ppb为1.742；0.1ppb为1.290；0.3ppb为0.810；0.9ppb为0.494； 2.7ppb为0.266；8.1ppb为0.152。则样本1的浓度范围是0.9ppb-2.7ppb，样本2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中氢化可的松的实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以氢化可的松标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氢化可的松的实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

         0.1        0.3         0.9        2.7       8.1

(ppb) [µg/kg]

图1：氢化可的松检测试剂盒的回归曲线

4、精密度：

%CV 

            0       0.1     0.3     0.9     2.7    8.1

 (ppb) [µg/kg]

图2：氢化可的松检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出氢化可的松检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应氢化可的松浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数均小于5%；可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】有效期12个月;生产日期、有效期、批号见外包装。