外泌体miRNA可通过细胞衰老途径参与结肠炎发生？

外泌体是直径为30-200nm的小囊泡，几乎来自所有细胞^[1]。外泌体中包裹了RNA、DNA、蛋白质和脂质，通过在不同细胞之间的传递，介导多种生理和病理过程。作为小的非编码单链RNA，microRNAs (miRNAs)通过转录后抑制基因表达，显著调节细胞生长和代谢，可以被包装在外泌体中以防止RNase的消化并进入循环，可作为潜在的疾病生物标志物^[2]。

图1 外泌体miRNA分泌机制

2023年8月7日，武汉大学人民医院董卫国教授团队在国际学术期刊Gut Microbes在线发表了题为“Exosomal-miR-129-2-3p derived from Fusobacterium nucleatum-infected intestinalepithelial cells promotes experimental colitisthrough regulating TIMELESS-mediated cellular senescence pathway”研究性论文（IF 12.2）。该研究揭示了具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)通过外泌体加重溃疡性结肠炎(UC)的分子机制，为UC的诊断和靶向治疗提供了新的理论支持。

图2 文章信息

核梭杆菌(Fn)感染可加剧溃疡性结肠炎(UC)。然而，Fn感染的肠上皮细胞(IEC)衍生外泌体(Fn-Exo)与UC进展之间的联系尚未被研究。该研究通过miRNA测序鉴定了Fn-Exo和未感染的IEC衍生外泌体(Con-Exo)中差异表达的miRNA。然后，在体外和体内确定Fn-Exo在UC发育中的生物学作用和机制。作者发现外泌体将miR-129-2-3p从Fn感染的IECs传递到未感染的IECs，加剧上皮屏障功能障碍和实验性结肠炎。机制上，Fn-Exo通过miR-129-2-3p/TIMELESS轴诱导DNA损伤，随后激活ATM/ATR/p53通路，最终促进细胞衰老和结肠炎症。总之，Exo-miR-129-2-3p/TIMELESS/ATM/ATR/p53通路加重了细胞衰老、屏障损伤和实验性结肠炎。目前的研究揭示了Fn感染性UC进展中的一个前所未知的调控途径。此外，血清中的外泌体-miR-129-2-3p可能作为UC和Fn-high-UC的新型潜在诊断生物标志物^[3]。

图3 Fn-Exo在结肠炎中的作用和机制示意图

一、爱必信拥有全套的外泌体&miRNA解决方案

图4 爱必信外泌体&miRNA解决方案

1、miRNA提取

一般来说，传统的TRIzol及其它常用的RNA提取试剂盒提取的是较大分子的RNA，包括rRNA和mRNA，但对miRNA的提取效果显著不佳。这可能是因为如此小的核酸分子不易被醇类沉淀、也不易被核酸纯化膜和磁珠吸附捕捉的原因。因而，要较好地提取miRNA，必须采取一些新的思路和方法。根据目前的研究结果显示，miRNA富集法应该是一种不错的选择。其原理为，先使用富集试剂将含量较低、分子量较小的miRNA聚集在一起，再使用核酸纯化柱进行提取。显然，miRNA聚集后更加有利于miRNA的吸附和捕捉，从而得以有效地提升miRNA的提取得率。
 

爱必信研发了可高效提取各样本中miRNA的专门试剂盒，与部分同类试剂盒相比，显著提升了miRNA的提取效率。

1）采用独特的消化技术，去除较大分子的DNA和rRNA, 使miRNA更容易分离提取
2）采用miRNA富集技术，使miRNA聚集起来，使之更容易被核酸纯化膜吸附纯化，大幅提升miRNA的提取效率；
3）操作简便，只需30多分钟即可获得理想的miRNA提取结果。

2、miRNA逆转录&qPCR

miRNA逆转录的难点在于其分子较小，逆转录引物无法理想地与miRNA结合。显然，进行miRNA逆转录时，需要对miRNA分子进行加长改造。有两种方法可达到这一目的：一种采用Poly(A)加尾法，另一种采用茎环法。对于加尾法逆转录来说，miRNA能否有效加长的关键在于Poly(A)聚合酶的活性。Poly(A)聚合酶活性高，就可以在短时间内给miRNA加上较长的Poly(A)尾巴，使miRNA分子能够高效地结合Oligo(dT)引物。另外Oligo(dT)引物的设计也至关重要，如果是简单的Oligo(dT)，引物与miRNA的结合往往会发生错位，导致逆转录效率降低。高效的Oligo(dT)引物应该加入锚定碱基，从而使二者的结合更加特异高效。茎环法逆转录成功的关键在于茎环的设计，该茎环应能高效地与miRNA 3’端特异、高效地结合，同时还要能够顺利地折叠和打开。
 

miRNA qPCR相对较为简单，主要有染料法和探针法。两种方法相比，探针法特异性更强。不过如果miRNA能够高效提取，并且miRNA qPCR逆转录成功，无论miRNA qPCR选择何种方法，一般都会有较为理想的结果。
 

二、加尾法逆转录VS颈环法逆转录如何选择？
 

选择何种miRNA逆转录以及定量方法，主要由实验来决定。对于从事较多miRNA（3个以上）研究的研究者来说，选用加尾法逆转录试剂盒较好，因为一次逆转录后可以进行多个miRNA的qPCR扩增，省去了很多的实验操作。但对于只检测1-2个miRNA的研究者来说，选用茎环法比较合适，因为茎环法逆转录结果更加特异。
 

需要特别注意的是，miRNA逆转录试剂盒和miRNA qPCR试剂盒一般是配套使用的，研究者买我公司配套的miRNA逆转录试剂和qPCR试剂，否则，有可能出现实验失败。其主要原因是逆转录引物上往往设计有qPCR引物结合序列，如果买不同厂家的试剂，qPCR引物可能无法特异地结合逆转录产物。另外，对于初学者而言，miRNA上游引物的设计有一定难度，往往既花了时间，又得不到好的实验结果，建议购买能够赠送上游引物的逆转录试剂生产厂家。
 

1）凡购买miRNA逆转录和定量试剂盒一套，即可免费获得逆转录&qpCR引物；
2）凡购买miRNA逆转录和定量试剂盒一套支持miRNA引物定制合成服务。

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参考文献

[1] Pegtel DM, Gould SJ. Exosomes. Annu Rev Biochem. 2019;88:487–514. doi: 10.1146/annurev-biochem-013118-111902.

[2] Jeppesen DK, Fenix AM, Franklin JL, Higginbotham JN, Zhang Q, Zimmerman LJ, Liebler DC, Ping J, Liu Q, Evans R, et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 2019;177(2):428–445.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.029.

[3] Wei S, Wu X, Chen M, Xiang Z, Li X, Zhang J, Dong W. Exosomal-miR-129-2-3p derived from Fusobacterium nucleatum-infected intestinal epithelial cells promotes experimental colitis through regulating TIMELESS-mediated cellular senescence pathway. Gut Microbes. 2023 Jan-Dec;15(1):2240035. doi: 10.1080/19490976.2023.2240035. PMID: 37550944; PMCID: PMC10411316.

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