绿原酸和菊花多糖免疫调节作用的研究

［摘　要］ 目的　探讨菊花中绿原酸和多糖成分对肠道免疫功能的调节作用。方法　提取金菊花中多糖成分；分离大鼠肠道淋巴细胞，分别与菊花中多糖、绿原酸共培养，ＥＬＩＳＡ法检测上清液中肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）α和γ干扰素（ＩＦＮ）水平；比较菊花中多糖、绿原酸对肠道淋巴细胞免疫功能的调节作用。结果　菊花多糖和绿原酸均可促进淋巴细胞上清液中ＴＮＦα和γＩＦＮ水平升高；菊花多糖对肠道上皮内淋巴细胞影响较小；绿原酸对肠道上皮内淋巴细胞功能影响显著。结论　金菊花中菊花多糖和绿原酸可调节肠道淋巴细胞分泌ＴＮＦα和γＩＦＮ，具有免疫调节功能。

［关键词］绿原酸；免疫调节  菊花提取物   菊花提取物绿原酸 

菊花是菊科植物菊（ＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍＲａｍａｔ）的干燥头状花序，为多年生草本，性味甘苦，具有疏风、清热、明目、解毒的功效，主治头痛、眩晕、目赤、心胸烦热、疗疮、肿毒等［１］，益血润容”。化学成分研究表明菊花的成分比较复杂，其中黄酮类化合物、三萜类化合物和挥发油是其主要有效成分。现代药理学研究表明，菊花具有抗菌、抗炎、抗氧化、舒血管、降血脂、抗肿瘤、驱铅等多种药理作用。有研究表明菊花中绿原酸含量较高［２］，且绿原酸具有刺激肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）α和γ干扰素（ＩＦＮγ）分泌的作用［３，４］。但有关菊花免疫调节作用研究较少，菊花免疫调节成分不明。笔者最近的研究证明菊花中含有多糖类物质，且其含量较高，相对分子量较大，具有多糖类物质的结构特征［５］。多糖为大分子化合物，研究发现多糖参与和介导了多种细胞功能的调节，它们能够刺激多种免疫细胞，促进白细胞介素（ＩＬ）、ＴＮＦα、ＩＦＮγ等细胞因子的分泌，调节抗体和补体等来调节免疫系统［６］。因此推测多糖为菊花免疫调节的有效成分。肠内的淋巴细胞比任何器官多，且肠道接触抗原的表面积，所以肠道是体内的免疫器官。肠道相关的淋巴组织包括派伊尔结、黏膜归巢受体、分散在黏膜固有层和肠上皮中的大量淋巴细胞［７］。因此本研究以肠道黏膜免疫系统为作用对象，筛选菊花中免疫调节活性成分，探讨菊花多糖（ＤＭＰ）和绿原酸（ＣＧＡ）的免疫调节活性。

１　材料与方法

１．１　试药 Ｆｉｃｏｌｌ（美国公司），ＤＨａｎｋ液，ＲＰＭＩ１６４０培养液（ＧＩＢＣＯ公司），Ｐｅｒｃｏｌｌ（美国Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司），Ⅱ型胶原酶（美国Ｓｉｇｍａ公司产品），ＦＩＴＣ标记ＣＤ４单克隆抗体、ＲＰＥ标记ＣＤ４单克隆抗体、ＲＰＥＣｙ５标记ＣＤ８单克隆抗体（美国Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司），γ干扰素ＥＬＩＳＡ试剂盒（晶美生物公司），ＴＮＦαＥＬＩＳＡ试剂盒（晶美生物公司）。金菊花鲜样采自湖北荆州金菊花种植园，由华中科技大学同济医学院附属协和医院中药师张玉良鉴定为ＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａｍｒｉｆｏｌｉｕｍＴｚｖｅｌ．ｅｔＺｈａｏ。绿原酸（中国药品生物制品检定所，批号：０７５３９９１０）。

１．２　动物 ＳＤ雄性大鼠，清洁级，体重（１９０±１０）ｇ，

由同济医学院实验动物中心提供。

１．３　方法

１．３．１　菊花多糖提取 参考文献［５］方法，以水提醇

沉法提取菊花多糖，制成注射剂备用。

１．３．２　分离外周血单核细胞（ＰＢＭＣ） 取大鼠外周

血３ｍＬ，肝素抗凝，用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心法分离出单

核细胞。

１．３．３　分离派伊尔结淋巴细胞（ＰＰ） 参照文献［８］

方法获取派伊尔结，机械粉碎，制成ＰＢＳ混悬液，３００

目筛网滤过，再利用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心法分离出淋

巴细胞。

１．３．４　分离上皮内淋巴细胞（ＩＥＬ） 参考文献［９］方法，取大鼠小肠，用含抗生素的ＤＨａｎｋ液冲洗肠腔，翻转小肠使黏膜面向外，置于盛有消化液的离心管中。消化，过滤，离心。去上清液，加ＲＰＭＩ１６４０培养液。Ｐｅｒｃｏｌｌ非连续密度梯度离心法分离得上皮内淋巴细胞。

１．３．５　分离肠道固有层淋巴细胞（ＬＰＬ） 将上述消化１次后的肠道组织加入含有０．１％Ⅱ型胶原酶的ＲＰＭＩ１６４０培养液中。再次消化，滤过、离心、去除上清液，加ＲＰＭＩ１６４０培养液。Ｐｅｒｃｏｌｌ非连续密度梯度离心法分离得肠道固有层淋巴细胞。

１．３．６　细胞培养 将上述分离出的淋巴细胞加入含１０％胎牛血清培养液，调节细胞浓度为１×１０６个/ｍＬ，取细胞悬液分别置于９６孔培养板，分别加入不同浓度菊花多糖（ＤＭＰ）和绿原酸（ＣＧＡ），对照组加入等量培养液。细胞置３７℃、５％ＣＯ２恒温培养箱中孵育４８ｈ，定期观察淋巴细胞生长情况，留上清液备用。

１．３．７　ＩＦＮγ、ＴＮＦα水平检测 参照试剂盒说明书，检测培养上清液中ＩＦＮγ和ＴＮＦα水平。向９６孔板中分别加入待测上清液和标准品１００μＬ，室温下孵育２ｈ；用洗涤缓冲液洗５次，加入检测抗体１００μＬ，室温下孵育１ｈ；用洗涤缓冲液洗５次，加入辣根过氧化物酶底物１００μＬ，室温下孵育３０ｍｉｎ；用洗涤缓冲液洗５次，加入底物１００μＬ，室温孵育１５ｍｉｎ后，加入终止液５０μＬ，酶标仪检测吸光度（Ａ）值。

１．４　统计学方法 计量资料用ｘ±ｓ表示，组间比较用ｔ检验。

２　结果

２．１　对淋巴细胞上清液中ＩＮＦγ水平的影响 菊花多糖可以使外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）和派伊尔结淋巴细胞（ＰＰＬ）上清液中ＩＮＦγ水平升高，与对照组比较，差异有极显著性（Ｐ＜０．０１）；对派伊尔结淋巴细胞的作用在高剂量组时较大。菊花多糖对上皮内淋巴细胞（ＩＥＬ）上清液中ＩＮＦγ水平影响不大。绿原酸对上皮内淋巴细胞上清液中ＩＮＦγ水平影响较大，与对照组比较，差异有极显著性（Ｐ＜０．０１）；绿原酸对肠道固有层淋巴细胞（ＬＰＬ）上清液中ＩＮＦγ水平影响较大，与对照组比较，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）（表１）。

２．２　对淋巴细胞上清液ＴＮＦα水平的影响 菊花多糖刺激外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）和派伊尔结淋巴细胞（ＰＰＬ）上清液ＴＮＦα水平升高，与对照组比较，差异有极显著性（Ｐ＜０．０１）。绿原酸对上皮内淋巴细胞（ＩＥＬ）上清液中ＴＮＦα水平影响较大，与对照组比较，差异有极显著性（Ｐ＜０．０１）。绿原酸对肠道固有层淋巴细胞（ＬＰＬ）上清液中ＴＮＦα水平也有影响，与对照组比较，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。绿原酸高剂量时可促进外周血单核细胞分泌ＴＮＦα，与对照组比较，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。。 

３　讨论

多糖是一类由单糖组成的天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。其中植物多糖如人参、枸杞、芦荟、牛膝、刺五加等均具有显著的药效功能，如增强免疫功能、抗肿瘤、降血糖、抗衰老、抗病毒作用等［６］。本实验结果表明菊花多糖可以激活外周血和派伊尔结中的单个核细胞和淋巴细胞，调节ＩＦＮγ和ＴＮＦα的分泌，发挥免疫调节作用。据文献［４，１０］报道，绿原酸在体内体外可刺激淋巴细胞分泌ＴＮＦα和ＩＮＦγ。体外研究显示绿原酸不仅可显著增强流感病毒抗原引起的Ｔ细胞增殖，并且能诱导人淋巴细胞及人外周血白细胞生成ＩＦＮγ及ＩＦＮα。本研究结果与文献结果一致。菊花多糖和绿原酸可调节淋巴细胞分泌ＴＮＦα和ＩＮＦγ，发挥免疫调节作用，但作用效果却有差异。二者免疫调节的作用机制有待深入研究。

［参考文献］

［１］　盛　蒂，郭亚勤，王旭东，等．七种栽培类型菊花的植物学特征、产量及有效成分比较研究［Ｊ］．中草药，www.staherb.com２００６，３７（６）：９１４．

［２］　徐文斌，郭巧生，李彦农，等．药用菊花不同栽培类型内在质量的比较研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００５，３０（２１）：１６４５－１６４８．

［３］ ＣＨＩＡＮＧＬＣ，ＮＧＬＴ，ＣＨＩＡＮＧＷ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ，ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ，ｉｒｉｄｏｉｄｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓａｎｄｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｏｆＰｌａｎｔａｇｏ

ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔａＭｅｄ，２００３，６９（７）：６００－６０４．

［４］ＷＡＮＧＪ，ＭＡＺＺＡＧ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓａｎｄｏｔｈｅｒ ｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒａｌｐｈａｉｎＬＰＳ／ＩＦＮｇａｍｍａａｃｔｉｖａｔｅｄＲＡＷ２６４．７ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２００２，５０（１５）：４１８３－４１８９．

［５］　马　力，陈　文，张嵩安，等．醇析水提法提取菊花中菊花多糖［Ｊ］．医药导报，２００７，２６（５）：４６７－４６８．上禾生物

［６］　陈　旋，张　翼，张剑波．植物多糖的研究进展［Ｊ］．中国新药杂志，２００７，１６（１３）：１０００－１００５．

［７］　李国平，杨　恬．黏膜免疫系统的研究进展［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００１，１７（６）：５９４－５９６．www.staherb.com

［８］　ＺＨＯＵＪ，ＸＩＡＯＣ，ＺＨＡＯＬ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅｏｎＣＤ＋４ａｎｄＣＤ＋８ｃｅｌｌｓｉｎＰｅｙｅｒ＇ｓｐａｔｃｈｏｆＳＤｒａｔｓｗｉｔｈｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００６，６（２）：１９８－２０３．

［９］　ＷＹＡＴＴＣＲ，ＢＲＡＣＫＥＴＴＥＪ，ＰＥＲＲＹＭＡＮＬＥ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇａｍｍａｄｅｌｔａＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｔｈａｔｐｏｐｕｌａｔｅｃａｌｆｉｌｅａｌｍｕｃｏｓａａｆｔｅｒｂｉｒｔｈ［Ｊ］．ＶｅｔＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，１９９６，５２（１２）：９１－１０３．

［10］ www.staherb.com    www.staherb.cn