看！心血管疾病研究--HTRF技术怎么做？

发布人：上海优宁维生物科技股份有限公司

发布日期:2022/8/31 11:02:21

本文涉及应用技术：均相时间分辨荧光（HTRF&TR-FRET）。来看研究人员是如何利用HTRF技术助推心血管疾病的研究的吧。
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一氧化氮信号通路研究
一氧化氮（NO）是自分泌和旁分泌的信号通路分子，可以扩散进入生物膜。发挥作用时间很短，促进血管动态平衡。能够抑制平滑肌收缩生长，阻止血小板凝聚以及防止白细胞-内皮细胞粘附。另外它还参与免疫防御系统，神经传递，血管生成等过程。研究表明，这种配体/受体长期低表达可能是高血压、心力衰竭、心肌梗死、中风和死亡的发病的关键。因此，NO-sGC信号通路广泛用于可恢复功能缺陷的治疗药物的研究。

2011年，Ramanathan等人在研究新发现的sCG抑制剂血栓反应蛋白-1(TH-1)，这是一种与多种膜受体(包括CD47)结合的多结构域蛋白。他们对活细胞和细胞裂解物进行了HTRF cGMP检测，以评估在NO存在的情况下，各种情况对sGC活性的影响。结果表明，TH-1的E3CaG1片段与CD47结合时，抑制NO-sGC信号(图2.A)。在E3CaG1存在下，加入CD47抗体，NO-sGC信号增强(图2.B)。此外，E3CaG1与CD47结合引起细胞内钙离子增加，cGMP减少(图2.C)。

药物的发现
2018年，Tobin等人研究IW-1973，一种新开发的sGC激动剂。作者通过HTRF技术检测cGMP、总VASP和磷酸化VASP（Ser 239）来检测其功能。结果表明，在30mM NO条件下，IW-1973激活sGC，EC50为267 nM。对cGMP的影响很低，对VASP磷酸化的影响达到峰值为78%。

药物的高通量筛选
高甘油三酯水平与心血管疾病的患病风险相关。载脂蛋白CIII(ApoC-III)（在脂解和脂质合成中的作用）是它们的关键调节因子和治疗应用的合理靶点之一。

2017年，Jun Lee和Mahankali等人旨在识别可能显示出治疗效果的ApoC-III的小分子抑制剂。使用HTRF ApoC-III检测，他们筛选了超过95万种化合物，并确定了抑制率高于50%的化合物，并对其进行了进一步的研究（图4）。

结果显示，反式维甲酸(atRA)可能是有效的抑制剂。被认为是与两个受体家族相关(RARs和RXRs)，作者进一步使用HTRF载脂蛋白分析来确定atRA对ApoC-III的影响仅是通过RARs介导的。

总的来说，对ApoC-III分泌的各种RAR受体激动剂进行了研究。AM580最有效的减少ApoC-III分泌，有效改善高脂饮食小鼠的体重、肝脏状况、心脏状况和甘油三酯水平。这些研究表明，一种RARα特异性激动剂可能为降脂和降低CVD风险提供了一种新的策略。

表征配体的功能研究--新开发抗β-Arestin受体配体
β-Arestin是一种多功能信号蛋白，主要作用于GPCR脱敏，通过β-1-肾上腺素能受体激活EGFR/ERK信号，已被认为在心力衰竭模型中具有心脏保护作用。

为了更好地和直接观察表达β-Arestin受体（βAR）的细胞和组织的生理和病理功能，Mitronova等人（2017）开发此类受体的荧光配体。用荧光基团标记已知的βAR拮抗剂卡唑洛尔和激动剂BI-167107，米特罗诺娃的团队进行了配体-受体结合实验和生物活性的分析。HTRF Tag-lite β1AR或 β2AR分析来确定解离常数（Kd），通过检测cAMP分析评估新配体的效力。

结语：该文章提供了HTRF技术在心血管相关研究的中的相关思路并得到验证的数据。为心血管疾病研究的道路“开辟捷径”，主要研究思路包括：
①候选药物的药理特性分析；
②对潜在分子的化合物进行高通量筛选：HTRF高通量筛选平台；
③受体-配体相互作用的研究：HTRF Tag-lite（基于细胞膜受体-配体）；
④深入研究信号通路：磷酸化蛋白和总蛋白检测，生物标志物检测。