蛋白实验中常用的巯基类还原剂

发布人：Suzhou yacoo science co.,Ltd

发布日期:2017/12/31 19:21:10

在生物化学和分子生物学中，还原剂可用来还原蛋白质或者多肽链中的二硫键，降低蛋白聚集。常用的还原剂有β-巯基乙醇（BME）、二硫苏糖醇（DTT）以及三-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（TCEP-HCl）。它们各有什么特点和作用呢？本文将一一进行介绍和对比。

β-巯基乙醇（BME）

BME只含有一个巯基，还原性最差，其作用只能维持2~3天。挥发性强，具有臭鸡蛋气味，接触空气会迅速被氧化成一个二硫化物，因此被广泛用来保护蛋白。通常以5%浓度加入SDS-PAGE凝胶的上样缓冲液：裂解分子间的二硫键，使蛋白质亚基在SDS-PAGE上各自分开；裂解分子内的二硫键使亚基完全变性，保证肽链按照其链长迁移而不受二级结构的影响。

二硫苏糖醇（DTT）

DTT有两个巯基基团，还原性强于BME，作用能维持3~7天。DTT的刺激性和毒性都低于BME，稳定性高于BME。DTT在pH 6.5~9.0内都具有活性，工作范围为7.1~8.0。但是随着pH值的降低，其有效还原性也随之降低。

DTT可用作还原剂：还原蛋白和多肽中的二硫键；抗氧化剂：保护活细胞免受离子辐射；巯基化DNA的还原剂：巯基化DNA末端的硫原子在溶液中趋于形成二聚体，能明显降低后续偶联反应的效率；解毒剂：维持解毒系统的活性；此外还可以保持谷胱甘肽处于还原态；参与细胞代谢；用在如胱氨酸贮积症，或由于离子或金属毒性导致的疾病治疗过程中。但是DTT无法还原包埋于蛋白质结构内部的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如盐酸胍、尿素或SDS）。

三-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（TCEP-HCl）

TCEP的还原能力比BME和DTT都强，其作用可以维持2~3周。pH范围广（1.5-8.5），且无臭味，兼容性好。TCEP是一种极为合适的部分还原试剂，对还原二硫键选择性极强，除半胱氨酸外，几乎没有与其它氨基酸的副反应。TCEP可用作还原剂：还原蛋白和多肽中的二硫键，防止蛋白半胱氨酸残基链间和链内的二硫键形成；螯合剂：与金属离子如Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)和Ni(II)等反应。临床检验上，TCEP主要用于同型半胱氨酸测定试剂盒，作为还原剂将氧化型同型半胱氨酸转化为游离型的同型半胱氨酸。

在实际使用中，需要注意含砷化合物、硝酸铵、过氧化氢、高氯酸钾、硝酸钠不能与还原剂共用。另外，DTT可使Ni²⁺被还原，因此在用Ni²⁺柱纯化His标签的蛋白时要避免使用DTT；碱性条件下，BME和TCEP比DTT更稳定，酸性条件下，TCEP的稳定性也好过DTT。DTT已经逐渐取代了传统的BME，而TCEP以更优的稳定性、更广的兼容性和更高的还原能力，成为公认的DTT的良好替代物。