上海源叶生物科技有限公司

实验方法原理 质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
实验材料 质粒DNA 重组DNA
试剂、试剂盒 LB培养基 蒸馏水 IPTG X-gal 氨苄青霉素
仪器、耗材 旋涡混合器 微量移液取样器 移液器吸头 离心管 双面微量离心管架 干式恒温气浴 恒温水浴锅 制冰机 恒温摇床 培养皿 超净工作台 酒精灯 玻璃涂棒 恒温培养箱
实验步骤 一、实验材料准备

1. 器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

2. 试剂

培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。

3. 材料处理

无菌ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

二、操作步骤

1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。

2. 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100 μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3. 加入5 μl 连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。

4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5 min。

5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。

6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

8. 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

10. 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。收起

注意事项 1. 玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂。