外泌体实验数据波动大、重复难？无外泌体胎牛血清从源头消除内源干扰。

外泌体（Exosome）作为直径30–150nm的细胞外囊泡，携带蛋白质、miRNA、mRNA及脂质等生物活性分子，是细胞间通讯的重要载体，在肿瘤转移、免疫调控、干细胞治疗、液体活检等领域均是研究热点。然而，许多科研人员在开展外泌体相关实验时，常常遭遇NTA定量偏高、WB标志物出现杂带、测序结果混入异种核酸、平行实验重复性差等问题。排查一圈后才发现，问题并非出在提取方法或操作手法，而是细胞培养体系中最基础的添加剂——胎牛血清（FBS）本身就携带着大量牛源外泌体，成为实验数据失真的核心内源干扰源。

一、为什么外泌体实验总做不准？血清内源囊泡是隐形干扰源

常规胎牛血清取自健康胎牛血液，牛体内各类细胞会持续向外周血液分泌大量囊泡。在传统血清制备流程中，仅进行除菌过滤，并无专门去除外泌体的工艺步骤，因此成品血清中天然富含牛源细胞外囊泡。据文献报道，普通胎牛血清中外泌体颗粒浓度可达10⁹–10¹⁰particles/mL级别，携带CD9、CD63、TSG101等经典外泌体标志物以及大量牛源miRNA。

当研究者用含普通血清的完全培养基培养细胞并收集上清提取外泌体时，最终得到的样本实际上是"细胞分泌外泌体+血清本底牛源外泌体"的混合物。这种混合体会从多个维度干扰实验结果：

• 1、定量层面：NTA纳米颗粒跟踪分析会将牛源囊泡一并计入，导致颗粒数显著偏高，无法准确反映细胞真实的外泌体分泌量。

• 2、蛋白层面：Western Blot检测CD63、CD81等标志物时，会出现血清来源的杂带，影响目的条带的灰度定量；蛋白质谱分析则会混入大量牛源白蛋白、免疫球蛋白等高丰度蛋白，掩盖细胞来源的低丰度功能蛋白。

• 3、核酸层面：牛源外泌体携带的miRNA、mRNA会污染测序文库，造成转录组数据背景噪音大、差异基因筛选失真，尤其在进行miRNA测序、circRNA分析时影响更为显著。

• 4、功能层面：血清外泌体本身具有生物学活性，可促进细胞增殖、迁移、抗凋亡，在开展外泌体功能获得/缺失实验时，会造成假阳性结果，严重干扰机制解读。

发表于Journal of Extracellular Vesicles的研究指出，18小时超速离心方案可去除胎牛血清中约95%含RNA的细胞外囊泡，并显著降低血清囊泡对上皮细胞迁移的促进作用，从实验层面证实了血清内源囊泡的功能干扰效应。

二、什么是无外泌体胎牛血清？定义与制备工艺详解

无外泌体胎牛血清（Exosome-Depleted FBS）是专为外泌体研究开发的特种细胞培养血清，以优质胎牛血清为原料，通过多级物理去除工艺最大限度清除内源牛源囊泡，同时完整保留生长因子、氨基酸、激素、维生素等细胞增殖必需的营养组分，兼顾培养性能与实验纯净度。

主流制备工艺采用"超速离心+纳米过滤"联合方案，核心流程如下：

• 第一步：原料筛选。选用来源清晰、无疯牛病（BSE）风险区域的健康胎牛血清，经初筛确保内毒素、血红蛋白、总蛋白等基础指标达标。

• 第二步：多级超速离心。将血清稀释后置于超速离心机中，以100,000×g以上的相对离心力连续离心18小时左右，利用密度差异使外泌体等纳米级囊泡沉降至管底，弃去沉淀，收集上层澄清血清。超速离心是目前公认的外泌体去除金标准方法，Shelke等人的对比研究证实，18小时离心时长在去除效率与营养保留之间达到最佳平衡。

• 第三步：纳米级终端过滤。离心后的上清依次通过0.22μm、0.1μm乃至更小孔径的无菌滤膜，进一步截留残余囊泡颗粒与微生物，实现除菌与除囊泡双重目的。

• 第四步：质控与分装。成品需通过NTA颗粒浓度检测、CD63蛋白定量、细胞增殖验证、支原体检测、内毒素检测等多重质控，合格后无菌分装冻存。

以爱必信无外泌体胎牛血清为例，由无菌采集健康胎牛血清过滤而成，外泌体经典标志物CD63含量可降至3.125pg/mL以下，内源外泌体去除率达96%以上。

三、无外泌体胎牛血清vs普通胎牛血清：核心差异在哪里？

很多研究者会担心：去除了这么多囊泡，会不会影响细胞生长？实际上，二者的基础营养组分高度一致，核心区别仅集中于外泌体含量与实验适配性，细胞常规培养性能并无本质差异。

简言之，无外泌体胎牛血清只"减去"了干扰实验的囊泡，不"损失"细胞需要的营养。对于不涉及外泌体检测的常规细胞培养，普通血清完全够用；但只要实验终点涉及外泌体的分离、鉴定、组学或功能研究，无外泌体血清就是刚需配置。

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参考文献

1.Shelke GV, et al. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles, 2014, 3: 24783.

2.Lobb RJ, et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles, 2015, 4: 27031.

3.Patel GK, et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles, 2019, 8(1): 1422674.

4.Théry C, et al. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology, 2002, 2(8): 569-579.

5.Toxavidis V, et al. The dark side of foetal bovine serum in extracellular vesicle studies. Journal of Extracellular Vesicles, 2022, 11(10): 12268.