细胞衔接器推动肿瘤免疫治疗进入新时代！

近两年来，免疫细胞衔接器成创新药热门赛道，国内外巨头纷纷布局T细胞衔接器（TCE）管线。这类双特异性抗体可靶向肿瘤与免疫细胞，激活免疫系统杀伤肿瘤。

2025 年 5 月 20 日，发表在《Cell Reports Medicine》（IF：11）上的一篇文章带来研究新风向：NK细胞衔接器（NKCE）打破TCE安全性限制，在杀伤效力与安全性上展现出突破性治疗效果。

一、研究背景

T细胞衔接器是一种革命性的细胞免疫疗法，但因会诱导细胞因子释放综合征而发展受限。相较于T细胞，NK细胞释放的细胞因子更少，靶向NK和肿瘤细胞的NK细胞衔接器是一种更具潜力的疗法。

为了更好地设计和评估NKCE，亟需探究清楚NKCE和TCE释放细胞因子机制的差异以及治疗效果的差异。

二、研究思路

三、研究成果

核心结论

1.NK细胞和T细胞产生TNF的机制不同；

2.多靶点NKCE具有更强的肿瘤杀伤效果；

3.NKCE、TCE、整合IL-2疗法展现出不同的治疗优势。

研究结论

图一：NKCE在杀伤肿瘤细胞的同时释放最少的细胞因子

为直接对比NKCE与TCE的功能差异，实验首先构建靶向肿瘤抗原HER2的NKCE、TCE（NCR1×HER2 NKCE、CD3×HER2 TCE）（图A），二者与对应靶点亲和力相近（通过解离常数衡量）（图B）。用HER2阳性/敲除的JIMT1肿瘤细胞（HER2+/+ JIMT1-Luc、HER2⁻/⁻JIMT1-Luc）作为靶细胞，发现二者均能特异性杀伤HER2阳性细胞，TCE最大杀伤率（E_max）更高且杀伤效果更持久（图C），但是TCE会诱导大量细胞因子释放，NKCE则几乎无细胞因子释放（图D）。

为进一步研究肿瘤抗原表达水平对衔接器作用的影响，研究人员又构建了靶向CLL1（急性髓系白血病细胞中表达水平各异的一种肿瘤抗原）的衔接器（图E），分别用三种表面CLL1表达水平不同的细胞系（PL21、NOMO1和MOMO1-Luc）作为靶细胞（图F）。结果显示，NKCE杀伤效果高度依赖靶抗原密度，仅对高表达CLL1细胞有高效杀伤，对低表达细胞无作用；而TCE不受抗原表达水平影响，对三种细胞均有至少70%杀伤，且伴随着大量细胞因子释放（图G-H）。

综上，NKCE可引导NK细胞特异性杀瘤且细胞因子释放极少，但杀瘤效果依赖靶抗原密度，与TCE形成显著差异。

本研究体外细胞因子检测使用以下MSD试剂盒：

U-PLEX CAR-T Cell Combo 1 (hu) or V-PLEX Human Proinflammatory Panel I (MSD, Cat# K15338K, K15052D)

针对不同疾病引发的细胞因子风暴，还可采用以下MSD试剂盒进行检测：

图二：刺激阈值和TNF转运差异导致TNF水平不同

前文发现相较于TCE，NKCE处理后释放更少的细胞因子，这里讨论导致差异的原因。首先讨论受体密度的影响，检测发现T细胞表面的CD3表达量远远高于NK细胞表面的NCR1和CD16（图A），因此抗体刺激受体后，T细胞产生的TNF更多。

再排除受体影响，分析细胞内通路的影响。用PMA/离子霉素激活细胞内通路，发现在同等最大刺激条件下，二者细胞内TNF前体水平相当（图B-D），但T细胞分泌更多的TNF，提示差异与TNF加工分泌能力相关。TNF最初以跨膜蛋白的形式存在，需要经过ADAM17的蛋白水解切割才能转化为可溶性形式。使用强效抑制剂GW280264X抑制ADAM17，发现NK细胞表面TNF表达更低，且ADAM17蛋白量少于T细胞（图E-H）。

综上，NK与T细胞TNF分泌的差异源于TNF向细胞膜的转运能力及ADAM17介导的加工能力两方面的不同。

图三：整合IL-2的NKCE可实现持续的肿瘤杀伤

NKCE虽然释放的细胞因子较少，但相较TCE，对肿瘤细胞的杀伤作用缺乏持久性。先前研究发现通过TCE激活T细胞受体可导致IL-2释放，而IL-2能维持T细胞增殖。因此研究人员推测将NKCE与IL-2联用，也同样有助于维持NK细胞增殖。

NKCE工具从两方面优化：一是NKCE整合IL-2，发现IL-2可促进NK细胞增殖、提高存活率，增强NKCE对低抗原表达肿瘤细胞的杀伤率（图B-D）。二是构建多种靶向CLL1的NKCE（图A），探究结合双激活受体（NCR1+CD16）及整合IL-2的协同效应，证实双受体结合的NKCE杀瘤活性更强。进一步优化IL-2结构后，构建五种NKCE，其中NKCE-V（双受体结合+IL-2递送）杀伤效果最佳，且所有NKCE诱导的细胞因子释放量远低于TCE。即使是低抗原表达细胞，NKCE-V也呈现最佳的杀伤效果（图E-H），表明三信号通路协同可降低杀瘤阈值。

综上，同时结合多种受体并递送IL-2，是提升NKCE杀瘤活性的最佳策略。

图四：抗肿瘤反应中NK细胞与T细胞亚群的转录组特征

为了进一步探究IL-2增强NK细胞功能的机制，研究人员选择NKCE和TCE杀伤效能相近的PL21-Luc细胞作为靶细胞，分析不同衔接器处理后NK细胞和T细胞亚群（CD4+细胞和CD8+细胞）的转录组特征（图A-B）。

PCA分析显示细胞类型是导致转录组差异的主要原因，整合IL-2会导致NK细胞独立聚类，对基因表达影响最显著。将差异基因聚类，然后通路分析，发现TCE与整合IL-2的NKCE均增强细胞激活、毒性及细胞周期相关基因表达，但TCE处理能调控共刺激信号和检查点信号的相关基因，而NKCE处理则主要影响与脱颗粒和免疫调节相互作用相关的基因（图C）。

流式细胞术实验显示，两种衔接器处理均提升细胞毒性相关蛋白等多种蛋白的表达，但是这种表达使得T细胞显著增殖，而NK细胞轻微增殖。而且对PD-1和TIGIT的表达，不同细胞类型间也有差异：TCE处理会导致T细胞表面PD-1和TIGIT表达上调，NKCE仅上调TIGIT，而不影响PD-1。而且TCE和NKCE均能上调IL-2RA mRNA表达，但是只有T细胞表面CD25表达水平升高。

综上，衔接器激活NK细胞和T细胞的通路既有重叠又存在差异。

图五：NKCE可增强抗肿瘤免疫且无明显不良事件

为验证整合IL-2的NKCE体内抗肿瘤活性，并对比其与TCE的效果，实验采用携带NOMO1-Luc异种移植肿瘤的NSG免疫缺陷小鼠，将肿瘤细胞分别与T细胞/NK细胞混合种入，再给予对应衔接器处理。结果显示，NKCE-III、IV、V均能显著延缓肿瘤生长，其中NKCE-V抑瘤效果最强（图B），可激活NK细胞产生IFN-γ，促进其向肿瘤微环境浸润（图C），且无外周NK细胞扩增，NKCE-IV、V激活NK细胞的能力优于III（图D）。而植入T细胞的小鼠，即便不加TCE也因急性移植物抗宿主病出现肿瘤消退，且伴随IFN-γ升高及外周T细胞扩增，TCE处理进一步加强该效应（图E-F）。

综上，NKCE在NSG模型中可引发强效抗肿瘤反应，但因T细胞输注导致的急性移植物抗宿主病，无法在此模型中直接对比NKCE与TCE疗效。

图六：NKCE可增强抗肿瘤免疫且无明显不良事件

为对比NKCE与TCE体内疗效及安全性，先构建靶向muCD19的工具分子：可递送IL-2并结合NCR1的NKCE、半衰期延长型TCE，及IL-2对照组（图A）。在小鼠体内，三者对MC38-muCD19肿瘤的抑瘤率均达70%（图B），但NKCE无B细胞耗竭（图C），血清细胞因子水平显著低于TCE和单独使用IL-2的组别（图D），且能增加肿瘤微环境NK细胞浸润。

为验证单独激活NK细胞的作用，用缺乏T、B细胞的Rag2⁻/⁻小鼠接种B16F10-muCD19免疫冷肿瘤（对免疫治疗反应较差的肿瘤类型），高剂量NKCE抑瘤效果优于IL-2，低剂量促NK细胞浸润能力更强，二者均能增强NK细胞颗粒酶B表达（图E-G）。

综上，NKCE通过促进NK细胞浸润及功能增强发挥抑瘤作用，疗效可观且不良事件少于IL-2和TCE。

本研究体内细胞因子检测使用以下MSD试剂盒：

V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit (MSD, Cat# K15048D)

V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit (MSD, Cat# K15049D)

更多肿瘤免疫相关研究，可采用以下MSD试剂盒：

四、研究意义与局限性

研究意义：本研究揭示NKCE与TCE释放细胞因子数量的差异可能与激活受体表达量及信号阈值差异相关。通过构建多种结构的NKCE，提出优化策略：双激活受体（NCR1+CD16）协同结合可提升肿瘤杀伤能力，整合IL-2能实现与TCE相当的杀瘤效果，且不增加细胞因子释放，安全性优于非靶向IL-2。

局限性：NKCE与TCE的结构、受体密度差异可能影响实验结果；野生型与变体IL-2的NKCE疗效差异未明确；未系统排除肿瘤细胞对NK细胞活力的影响，内源性IL-2的作用及NK细胞TNF转运机制仍需深入研究，为NKCE优化提供方向。

本文中用于细胞因子检测的MSD技术，是一种高灵敏度的电化学发光检测技术，相关技术详情可参考优宁维科学仪器公众号文章《重磅发布 | MSD新一代科研机型Q60MM正式上市，开启蛋白精准分析新篇章》

MSD部分检测靶点

除了本研究中应用的细胞因子检测，MSD技术的应用场景还广泛覆盖基础研究、标志物检测、药物免疫原性检测、免疫检查点药物筛选，具体案例可查询：《【细胞治疗】Meso Scale Discovery(MSD)案例合集》《【ADC案例】PK/PD, ADA, 细胞因子》《【生物标志物案例】小鼠肝细胞癌模型的炎症因子MSD现货供应，扫码填写信息预订》《ELISA转MSD电化学发光(经典案例)：帕金森病-脑脊液-标志物》