HPLC-ELSD法测定山茱萸中熊果酸的含量

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Col7t11~offici,d~Sieb．et Zucc)的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、涩精固脱的功能。用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症_l1。《中国药典>200o版一部以薄层扫描法测定熊果酸含量作为山茱萸的含量测定指标，由于薄层扫描法难以较精确地定量．故2005年版药典“山茱萸”中含量测定改以高效液相法测定马钱苷含量为指标。但有学者指出，马钱苷与山茱萸的功能主治并无相关性。熊果酸为五环三萜类有机酸，具有较好的抗肿瘤活性，对6种不同的癌细胞具有显著的细胞毒作用[21。熊果酸含量的测定方法，除薄层扫描法外，还有高效液相法p1和衍生化气相色谱 等。熊果酸 分子中仅存着一个双键，只在紫外波长210 nm处有末端吸收．采用HPLC法进行检测时．受流动相影响较大，基线不够理想，检测灵敏度较低。而ELSD的检测不依赖于样品的光学特性。所以对于无发色团或荧光基团的样品较UV检测器及示差检测器有独特的优越性。考虑以上因素。现试用高效液相色谱一蒸发光散射检测(HPLC—ELSD)法对山茱萸的熊果酸含量进行测定。

1仪器与试药

Agilentl100高效液相仪(Alltech 2000 ELSD检测器、 Agilentl100色谱工作站)；Thermo超纯水仪；山茱萸(产地：浙江)；熊果酸(中国药品生物制品检定所，批号110742—20051 6)；甲醇(天津四友，色谱纯)；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

2方法与结果

2．1色谱条件

色谱柱为SHMADZU VP-ODS(4．6 mmx250．0 mm，5 m)，柱温30℃ ．流动相为甲醇：0．1％冰醋酸溶液(80：20)．流速为 1．0 ml／min，ELSD检测器漂移管温度为120℃ ，氮气流速为 2．0 ml／min。在此条件下，山茱萸中熊果酸的色谱图如图1、2。

2．2对照品溶液的制备

取熊果酸对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制得浓度为1．047 mgCml对照品贮备液，待用。

2．3供试品溶液的制备

取山茱萸药材打粉，过2号筛，取粗粉约0．5 g，精密称定，置于10 ml容量瓶中，加适量甲醇超声30 rain，放冷后定容，过0．45 I．Lm微孔滤膜，即得。

2．4线性关系的考察

取对照品储备液适量。依次稀释成10．48、20．96、31．44、 41．92、52．40、104．80~g／ml的溶液。分别吸取上述不同浓度对照品溶液10 l，注入色谱仪，按色谱测定条件测得峰面积，以进样量( g)的自然对数OnX)为横坐标，以峰面积的自然对数(1nY)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为lnY=1．551 1X lnX+0．756 4(r=O．999 6)，表明熊果酸峰进样量在0．104 8～ 1．048 0 Ixg范围内呈良好线性关系。

2．5稳定性试验

取供试品溶液，分别在0、2、46 8 12、24 h后进样，每次 l0 ，测定峰面积值。RSD值为0．78％，表明供试品溶液在 24 h内稳定

2．6精密度试验

吸取41．88 咖l的标准品溶液，连续进样6次，每次10 l，测各次峰面积。RSD值为0．47％。

2．7重复性试验

取同一批药材，精密称取5份，按上述供试品溶液方法处理。测定样品中熊果酸的平均含量为0．14％ ，RSD值为】I48％ 。

2．8回收率试验

取已知含量的山茱萸药材适量，精密称定9份，分别加入上述对照品贮备溶液0．5 rIll，按上述供试品溶液的方法制备溶液，依次进样测定，计算回收率。熊果酸的平均回收率为 99-4％ ．RSD值为O．45％，见表1。

2．9样品测定

取山茱萸药材供试品溶液在上述色谱条件下进样，用标准曲线法计算熊果酸的含量，测得药材中熊果酸平均含量为 0．14％。

3讨论

试验中发现以ELsD检测图杂峰少．基线平稳，熊果酸 的响应值大；而熊果酸的吸收波长210 nm下使用UV 检测器较难平衡，基线漂移．甲醇在此波长下有吸收，使得基线噪音大，故采用ELsD检测。

试验初设流动相为甲醇：水(80：20)，试验中发现此条件下熊果酸拖尾现象严重，在水中加入0．1％的冰醋酸可有效改善拖尾现象，得到满意的峰形，因此采用了甲醇：0．1％冰醋酸(80：20)为流动相。

熊果酸广泛存在于中药材中，如女贞子、夏枯草、马鞭草、山茱萸、山楂、木瓜、栀子、苦丁茶等，许多中药都以熊果酸作为活性指标和目标成分进行含量控制，此方法可作为广泛的测定中药材中熊果酸含量的参考方法。

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