文献解析|微流控技术结合流式细胞术快速发现病原体特异性单克隆抗体的创新方法解析

Rapid discovery of monoclonal antibodies by microfluidics-enabled FACS of single pathogen-specific antibody-secreting cells

单克隆抗体在预防和治疗病毒感染中发挥着越来越重要的作用，成为应对 pandemic 的关键工具。抗体分泌细胞（ASCs）是产生高亲和力抗体的重要来源，但当前研究 ASCs 的技术存在通量低、筛选过程繁琐或技术要求高等局限性。2024年8月发表于 Nature Biotechnology的研究提出了一种创新技术，通过将微流控单细胞封装与流式细胞术相结合，实现了对 ASCs 的高通量筛选。该方法在短短2周内成功从小鼠和人类 ASCs 中分离出针对 SARS-CoV-2 的高亲和力（<1 pM）中和抗体（<100 ng ml⁻¹），命中率超过85%。

技术原理与工作流程设计

该技术的核心创新在于将微流控单细胞封装与流式细胞术有机结合，解决了传统方法无法高效筛选 ASCs 的难题。ASCs 因其表面免疫球蛋白表达量低或缺失，无法通过常规流式细胞术进行抗原特异性分选。本研究通过设计一种抗体捕获水凝胶系统，成功实现了对分泌抗体的原位捕获和检测。

工作流程具体包括三个关键步骤：首先，将B细胞与苯甲基鸟嘌呤（BG）修饰的琼脂糖混合，通过微流控技术封装成直径25μm的单分散水包油液滴，形成稳定的水凝胶微环境。BG基团可与SNAP-tag发生特异性共价反应，研究人员通过表达抗轻链恒定区的VHHs-SNAP融合蛋白，构建了抗体捕获基质。这种设计使得分泌的抗体能被特异性地固定在水凝胶中，同时保持其抗原结合能力。

捕获系统的优势体现在多个方面：琼脂糖的大孔径（>100nm）保证了荧光标记抗原和检测抗体的自由穿透，而共价固定方式确保了抗体捕获能力不受细胞表面分子表达量的限制。通过GFP-SNAP饱和实验验证，每个水凝胶珠的捕获容量可达10⁹个分子，远超过单个ASCs的抗体分泌量（10³-10⁵个/小时）。与基于细胞表面捕获的方法相比，这种三维捕获系统具有更高的容量和均一性。

方法验证与小鼠模型应用

为验证技术的可行性，研究团队首先使用卵清蛋白（OVA）免疫的小鼠模型进行测试。通过磁性分选富集骨髓来源的浆细胞（CD138⁺），将其封装入VHHs功能化的水凝胶中。实验结果显示，封装过程对细胞活性无显著影响（4小时后存活率仍达92%），且最佳抗体分泌检测时间窗口为1小时45分钟。

共聚焦显微镜观察显示，OVA特异性IgG抗体与荧光标记抗原在细胞周围水凝胶中共定位，证实了分泌抗体的特异性捕获。通过流式细胞术分选OVA特异性ASCs，测序后获得两个单克隆抗体，其亲和力分别达到2.36 nM和0.68 nM，证明了该方法筛选高质量抗体的能力。

在SARS-CoV-2 RBD抗体筛选中，研究人员从免疫小鼠骨髓浆细胞中获得了54个抗体序列，涵盖21个不同的重轻链可变区基因组合。其中发现五个高度扩增的克隆，最大克隆占比达37%。通过ELISA验证，84.6%（22/26）的重组抗体显示RBD结合活性。值得注意的是，仅有两个抗体（mRBD1和mRBD2）表现出中和能力（IC₅₀分别为3.17μg ml⁻¹和4.61μg ml⁻¹），说明免疫反应产生的抗体中和活性具有选择性。

人类抗体发现与疫苗反应研究

将技术应用于人类样本时，研究人员分析了BNT162b2疫苗接种后7-9天的外周血单个核细胞（PBMCs）。通过阴性分选富集B细胞，使用抗人κ和λ轻链的VHHs构建捕获基质。实验发现，与未添加捕获试剂的对照组相比，只有功能化水凝胶能检测到显著的RBD特异性信号，证明该方法能有效捕获表面免疫球蛋白低表达的ASCs。

从单个志愿者中获得了185个浆母细胞序列，涵盖156个不同的VH序列和111个VH克隆型。与小鼠实验类似，也观察到显著扩增的克隆型，如IGHV4-34克隆（占比5.4%）。通过重组表达16个代表性抗体，94%（15/16）显示RBD结合活性，其中80%（12/15）具有中和野生型SARS-CoV-2的能力。最有效的中和抗体IC₅₀达到10-100 ng ml⁻¹，与临床使用的REGEN-COV抗体组合相当。

值得注意的是，10个中和抗体中有5个对Omicron BA.1变体保持中和活性，其中一个抗体（hRBD16）的中和能力下降最小（WT IC₅₀ 68 ng ml⁻¹ vs BA.1 IC₅₀ 398 ng ml⁻¹）。表位分组实验显示这些抗体靶向RBD上的两个不同竞争区域，解释了其中和活性差异的结构基础。

多参数筛选与表位特异性选择

该技术的另一优势在于流式细胞术的多参数检测能力。研究人员通过同时使用荧光标记的S1和RBD抗原，成功筛选出结合S1但不结合RBD的抗体。从疫苗接种7天后的PBMCs中分选S1阳性/RBD阴性的ASCs，通过指数排序分析选择信号比最高的四个序列进行表达。

其中三个抗体显示皮摩尔级亲和力，一个抗体（hS1-1）对野生型病毒具有中和能力（IC₅₀ 102.9 ng ml⁻¹）。ELISA验证证实这些抗体特异性结合S1而不结合RBD，证明了多参数筛选在靶向特定表位方面的有效性。这种能力对于开发针对保守表位的广谱中和抗体尤其重要，也为合理疫苗设计提供了重要工具。

技术优势与生物学意义

与现有技术相比，该方法具有显著优势。传统的杂交瘤技术耗时数月且通量低，而记忆B细胞筛选虽然高效但无法直接访问ASCs区室。基于微流体的单细胞技术虽然先进，但设备昂贵且操作复杂。本研究的技术使用常规流式细胞仪，每天可筛选超过10⁷个细胞，远超微流体分选仪（200-600 Hz）和微孔板系统（每芯片1，000-10，000个细胞）的通量。

从生物学角度看，该方法为了解免疫优势现象提供了新视角。通过对比CoV-AbDab数据库，发现9%的浆母细胞序列与已知SARS-CoV-2结合抗体属于相同VH克隆型，包括多个独立研究中出现的免疫优势克隆型（如IGHV3-53）。结构聚类分析进一步揭示了13个额外的共享表位群，表明不同克隆型可能靶向相同抗原位点。

技术的模块化设计使其可扩展到其他分泌蛋白的研究，如不同物种的抗体或细胞因子。轻链介导的捕获方式还可能用于研究抗体糖基化等翻译后修饰特征。虽然当前技术受限于细胞封装通量（最高10⁷细胞/小时）和测序效率，但通过优化微流体芯片并行数量和引入下一代测序技术，有望进一步提升性能。

讨论与展望

该研究建立了一个快速、简单、高通量的功能性抗体发现平台，首次实现了对ASC区室的高效访问。技术在 pandemic 应对方面展现出巨大潜力，能够在2周内从少量样本中获得数百个高质量抗体，真正阳性率超过85%，远超基于表面标记的无偏分选（平均20.3%）。

未来改进方向包括提高单细胞测序通量，整合DNA条形码抗原（如LIBRA-seq技术）实现数千个ASC抗体的序列-功能景观构建。此外，通过多抗原变体同步筛选，有望更系统地发现靶向保守表位的广谱中和抗体。

这项技术不仅为抗体药物开发提供了强大工具，也为理解体液免疫应答机制提供了新视角。随着传染病爆发风险的增加，此类快速抗体发现平台将显著提升全球 pandemic 应对能力，为未来传染病防控提供重要技术支撑。综上所述，该研究通过巧妙的工程学设计解决了ASC研究的技术瓶颈，建立了高效、可靠的抗体发现平台。其模块化、高通量的特点使其在基础免疫学研究和新疗法开发中都具有广泛应用前景，代表了单细胞技术应用于生物医学研究的重要进展。