金银花中绿原酸一步提取法及绿原酸抗菌活性

屈景年1 , 　莫运春1 , 　刘梦琴1 , 　李　荣2

(1. 衡阳师范学院化学与材料科学系,湖南衡阳421008 , 2 南华大学附属第二医院, 湖南衡阳421001)

摘　要:以乙酸乙酯和0. 05 molPLHCl 组成的混合溶液作萃取剂,从金银花中一步提取绿原酸,并研究了乙酸乙酯的体积分数、温度、浸取时间对提取绿原酸的影响和绿原酸的抗菌活性,实验结果:提取绿原酸实验条件是:温度65°C ,乙酸乙酯的体积分数0. 8 ,浸取时间3 h。提取物与金银花质量比为3. 21 % ,绿原酸的质量分数86. 3 %;同时测得绿原酸抗金黄色葡萄球菌的活性比抗大肠杆菌强。

关键词:金银花; 乙酸乙酯; 提取; 绿原酸; 抗菌活性

　金银花(Flos lonicerae) 是我国民间常用中草药,其味甘性寒,具有清热解毒功能[1] 。近年研究发现:金银花还具有抗HIV 病毒和抗肿瘤等作用[2] 。中医药理研究表明:金银花的主要药物活性成分是绿原酸(Chlorogenic acid) [3] ,其化学式C16H18O9 ,结构式为:

　绿原酸除医用外,还广泛用于食品保鲜剂和化妆品的抗衰老剂。具有十分广阔的应用前景[4 ,5 ] 。因而许多研究者对提取绿原酸产生极大兴趣,目前,国内报道绿原酸的提取工艺主要有稀醇法、水浸醇沉法和水提法等方法,这些提取方法得到的绿原酸纯度低[6 ,7 ] ,要得到较纯的样品还需要进行提纯,如乙酸乙酯萃取提纯法[8 ] 。提取周期长、溶剂用量大、成本偏高。鉴于以上原因,笔者在前人研究的基础上,探讨了乙酸乙酯一步法从金银花中提取绿原酸,

简化了提取工艺,并且提高了提取物中绿原酸的相

对含量,是一项具有实用价值的方法。

1 　实验部分

1. 1 　材料与仪器

金银花购于衡阳市敬一堂大药房中药部;甲醇、乙酸乙酯、盐酸(用蒸馏水配成0. 05 molPL 的稀溶液备用) 均为分析纯试剂(上海化学试剂公司) ;试验菌种(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌) 由南华大学附属第二医院提供,浓度为5000 万个PmL ,经稀释后为10 万个PmL 备用。UV22501 型紫外分光度计(日本岛津) ;PR252AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) ;恒温水浴(河南英谷恒温器厂) ;回流提取器(自组装) 。

1. 2 　实验方法

1. 2. 1 　绿原酸的提取

绿原酸是一种有机弱酸,在低酸度溶液中其电离过程被抑制,主要以分子形式存在,有利于用乙酸乙酯进行液2液萃取[9] 。本工作用乙酸乙酯和稀盐酸混合溶液作提取剂,从金银花中提取绿原酸,水是绿原酸溶出剂,盐酸是电离抑制剂,乙酸乙酯是萃取剂。称取30 g 金银花(研成粉末) ,加入240 mL 乙酸乙酯和60 mL 0. 05 molPL 盐酸,在65°C水浴上搅拌回流浸取3 h ,重复提取2 次(重复提取实验盐酸用量每次递减20 mL) ,趁热过滤,合并滤液分离出乙酸乙酯,用水洗涤,减压回收溶剂浓缩得到膏状物,用蒸馏水溶解膏状物过滤除杂,滤液在水浴上缓慢蒸发至干,真空干燥至恒重。

1. 2. 2 　绿原酸质量分数测定

采用分光光度法测定提取物中绿原酸的质量分数,准确称取40 mg 提取物,用甲醇溶解,在100 mL容量瓶中定容,经过适当稀释,以甲醇作参比,用分光光度计,在324 nm 下测定溶液的吸光度,将吸光度值代入文献[8 ]绿原酸标准样品吸光度曲线方程中,计算提取物中绿原酸的质量分数。

2 　结果与讨论

2. 1 　乙酸乙酯体积分数对提取绿原酸的影响在乙酸乙酯一步法中,酯是萃取剂,盐酸水溶液是浸取剂,乙酸乙酯与稀盐酸的体积比对提取绿原酸有较大的影响,实验结果见表1。

　  从表1 结果可见:乙酸乙酯体积分数较高时,水所占比例少不利于金银花的溶胀,绿原酸难以浸入液相,提取物的质量减少,提取率下降,反之,盐酸水溶液体积分数高时,浸取杂质的种类及含量都增加,造成分离过程绿原酸损失大,得率降低,根据实验综合效果乙酸乙酯体积分数为0. 8 时比较理想,提取物与金银花的质量比为3. 17 % ,绿原酸的质量分数

86. 4 %。

2. 2 　温度对提取绿原酸的影响

绿原酸易溶于水,但当温度降低时,溶解性变差,所以温度太低不利绿原酸的溶出,但温度过高时,会导致绿原酸分解,不同温度对提取绿原酸影响的实验结果见表2。

2. 3 　绿原酸得率与提取时间的关系

在乙酸乙酯一步法提取绿原酸过程中,存在溶解和萃取平衡,提取时间太短,溶解和萃取均未达到平衡,绿原酸得率低。提取时间过长,提取率几乎不再增加,实验结果见表3。

2. 4 　绿原酸提取方法比较

　　由实验结果(表4) 可见:乙酸乙酯一步萃取法明显优于其它方法。

2. 5 　绿原酸抑菌活性试验

采用平板法测试绿原酸对革兰氏阴性菌(大肠杆菌) 和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌) 的抑菌能力。培养皿和实验器材均经高温灭菌处理2 h ,普通肉汤琼脂培养基用稀碱调节pH为7 . 2～7 . 4 ,经121°C灭菌处理30 min ,取15 mL 培养基倾入平皿中冷却至室温,将1 mL 菌液平铺于平板中涂抹均匀,并在每只平板内放入4 只钢圈,钢圈内准确加入一定剂量的药物及0. 2 mL 生理盐水。以上所有操作均在100 级净化台上进行。然后在37°C培养箱中培

养24 h ,测量抑菌圈的面积,结果以抑菌圈直径表示,取3 次试验平均值列于表5 中。

　  根据实验结果可以看出;绿原酸对革兰氏阴性菌(大肠杆菌) 和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌) 均有抑菌活性。但抗金黄色葡萄球菌的活性比抗大肠杆菌活性更强,与文献[10 ] 结果一致。

3           结论

乙酸乙酯一步法从金银花中提取绿原酸的实验条件为:乙酸乙酯体积分数0. 8 ;提取时间3 h ;温度65°C。提取物与原料质量比3. 21 %;绿原酸的质量分数86. 3 %。如果进一步提纯可得到高纯绿原酸;绿原酸抗金黄色葡萄球菌活性比抗大肠杆菌活性更强。

参考文献:

[1] 　贺志光,中医学[M] . 北京: 人民卫生出版社,1983.147.

[2] 　吕维柏. 中医治疗爱滋病展望[J ] . 中医杂志,1992.(9) :49251.

[3] 　林启寿. 中草药成分化学[M] . 北京: 科学出版社,1977.

[4] 　马建华,钱素平,姚思德,等. 绿原酸对脱鸟苷酸氧化羟基加合物的快速修复[J ] . 中国科学(B 辑) ,1998 ,28(6) :2932295.

[5] 　刘海军,裘爱泳. 绿原酸及其提取纯化和应用前景[J ] . 粮食油脂,2003(9) :44246.

[6] 　冯文宇,田　吉. 绿原酸提取工艺对比实验的研究[J ] . 沪洲医学院学报,1999 ,22(6) :4692470.

[7] 　刘祥兰,刘重芳,张　英. 绿原酸提取工艺的比较研究[J ] . 中成药,2000 ,22(6) :4022404.

[8] 　阎巧娟,韩鲁佳,江正强. 金银花中绿原酸提取纯化工艺的优化[J ] . 中国农业大学学报,2002 ,7(2) :22226.

[9] 　(日) 关根达也,长谷川佑子著,滕藤,廖史书等译. 溶剂萃取化学[M] . 北京:原子能出版社,1981.

[10] 　丁学民,胡佐良,杨末芝,等. 常用中医方药手册[M] .长沙:湖南科技出版社,1982.

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