【阿拉丁】免疫组织化学实验方案

一、免疫组织化学 - 适用于石蜡切片方案

重要事项：请参阅阿拉丁官网产品数据表首页或产品网页的应用板块，以确定该产品是否适用于石蜡包埋（IHC-P）的组织切片。

注：有关适当的抗体稀释、稀释剂和去掩蔽溶液，请参阅产品特定协议。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水（RODI）或同等级别的水制备溶液。

1. 二甲苯。X112051

2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。E298965

3. 去离子水（dH2O）。W119424

4. 洗涤缓冲液：

a. 1× Tris Buffered Saline with Tween 20 （TBST）：要制备 1 L 1× TBST，将 100 mL 10× Tris Buffered Saline with Tween 20 （TBST）（T743331）加入 900 mL dH2O 中并混匀。

5. *抗体稀释剂的选择：

a. TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 mL 1× TBST 中添加 250 µL Normal Goat Serum（G752123）。

b. PBST/5% Normal Goat Serum：在 5 mL 1× PBST 中，加入 250 µL Normal Goat Serum（G752123）。

• 1× PBST：要制备 1 L 1× PBST，将 100 mL 10× Phosphate Buffered Saline with Tween 20（PBST）（P196391）加入 900 mL dH2O 中并混匀。

6. 抗体修复剂的选择：

a. 1× 柠檬酸盐修复液（C752119）：要制备 250 mL柠檬酸盐修复液，用重蒸水或Milli-Q水将本抗原修复液（50×）稀释50倍，配制成抗原修复液（1×），例如5mL本抗原修复液（50×）加入245mL重蒸水或Milli-Q水，混合均匀，即得250mL抗原修复液（1×）。

b. 1× EDTA 修复液E745530：要制备 250 mL 的 1× EDTA 修复液, 将 5 mL 的EDTA抗原修复液（50×）（E745530）用 245 mL 的 dH2O 进行稀释。

c. TE：10 mM Tris/1 mM EDTA，pH 值 9.0：要制备 1 L 溶液，将 1.21 g Tris 碱（C4H11NO3）T110601和0.372 g EDTA （C10H14N2O8Na2•2H2O）E274376 加入到 950 mL 的 dH2O 中。调整 pH 值至 9.0，然后用 dH2O 将最终溶液定容至 1 L。

d. 胰蛋白酶T105533或胃蛋白酶P736658：酶的中性缓冲液，常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。

7. 3% 过氧化氢H639762：要制备 100 mL 溶液，将 10 mL 30% H2O2 加入到 90 mL dH2O 中。

8. 封闭液：1× TBST/5% Normal Goat Serum 或者 1× Animal-Free Blocking Solution。

a. 1× TBST/5% Normal Goat Serum：将 250 µL Normal Goat Serum 加入到 5 mL 1×TBST 中。

b. 免疫染色封闭液：B751639。

9. 检测系统：HRP, Mouse Ab179001; HRP, Rabbit Ab176443;

Biotin, Mouse Ab156253; Biotin, Rabbit Ab176442; HRP 标记的链霉亲和素 np156148

10. DAB染色试剂盒：Detection Reagent D405772 

11. 苏木精：Hematoxylin H104304

12. 封固剂：Mounting Medium M292692

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：

a. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。

b. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。

c. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。

d. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

注：请参阅产品特定的协议，以获取有关揭露解决方案/实验步骤的具体建议。

1. 对于柠檬酸盐：将切片浸入1× 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度（95°C-98°C）10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

2. 对于 EDTA：将切片浸入 1× EDTA 修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度（95°C-98°C）15 分钟。无需冷却。

3. 对 TE：将切片浸入 pH 值为 9.0 的 10 mM Tris / 1 mM EDTA 溶液中，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度（95°C-98°C）18 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

4. 对于胰蛋白酶或胃蛋白酶：使用前预热至37℃，消化时间约为5-30分钟。

D. 染色

注：有关推荐的抗体稀释剂，请参阅产品特定实验步骤。

1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。

2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。

3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。

5. 在每个切片上滴加 100–400 µL首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。

6. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µL的一抗。

7. 4°C 孵育过夜。

8. 将 Detection Reagent 平衡至室温。

9. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

10. 根据需要，滴入适量覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。

11. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

12. 按照产品使用信息中的建议准备基材。

13. 将 100-400 µL DAB涂在载玻片上。监控反应。推荐的反应时间因使用的底物而异。请参阅产品使用信息，以了解具体指南。

14. 将切片浸入 dH2O 中。

15. 如果需要，按照说明书使用 Hematoxylin将切片复染。

16. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

17. 使切片脱水：                               

a. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。

b. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。

c. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。

18. 用盖玻片和 封片机进行封片。

二、免疫组织化学实验步骤 - 适用于冰冻切片

重要事项：请参阅产品网页，以确定某种产品是否经验证以及是否获批用于冷冻组织切片。请参见产品网页，了解合适的抗体稀释度和修复液。

注：请参见产品网页，了解产品特定的实验步骤建议。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 二甲苯。X112051

2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。E298965

3. 去离子水 (dH2O)。W119424

4. 苏木精（可选）：Hematoxylin H104304。

5. 20× 磷酸盐缓冲液 (PBS)：P492453为了制备 1 L 1× PBS：添加 50 mL 20× PBS 至 950 mL dH2O，然后将其混匀。

6. 固定液选择：请参阅产品数据表，以了解最佳的固定液。

a. 10% 中性缓冲福尔马林。F301880

b. 丙酮。A399740

c. 甲醇。M116124

d. 3% 甲醛：要制备 100 mL 溶液，将 18.75 mL 16% 的甲醛加入到 81.25 mL 的 1× PBS 中。

7. 10× Tris 盐缓冲液（TBS）洗涤缓冲液：（T743331）要制备 1 L 1× TBS 溶液，将 100 mL 的 10× TBS 加入 900 mL dH2O 中，并混匀。

8. 甲醇/过氧化物酶：制备方法：将 10 mL 30% H2O2 加入到 90 mL 甲醇中。储存于 -20°C 的温度下。

9. 封闭液：1× TBS/0.3% Triton X-100/5% Normal Goat Serum。制备方法：将 500 µL的山羊血清和 30 µL的 Triton X-100 加入到 9.5 mL 的 1× TBS 中。

10. 检测系统：HRP, Mouse Ab179001; HRP, Rabbit Ab176443; HRP, Goat Ab141534;

11. DAB染色试剂盒：Detection Reagent D405772

B. 切片制作

1. 针对储存在 -80°C 温度下的组织：切片前，从冷冻柜中取出组织样品，在 -20°C 的温度下均衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。

2. 将组织切成厚度在 6–8 µm 之间的切片，置于带正电荷的载玻片上。

3. 固定前，将切片放置在工作台上风干几分钟（这样可以增加切片的粘附作用）。

C. 固定剂的选择

注：请参考产品数据表，确定最佳的固定剂。

1. 组织切片晾干后，按照以下步骤使用最佳的固定剂固定。

a. 10% 中性缓冲福尔马林：在室温下固定10 分钟。立即进入染色步骤（D 部分）。

b. 冷冻丙酮：-20°C 温度下，冷冻 10 分钟。风干。立即进行染色（D 部分）。

c. 甲醇：-20°C 温度下，冷冻 10 分钟。立即进行染色（D 部分）。

d. 3% 甲醛：在室温下固定15 分钟。立即进行染色（D 部分）。

e. 3% 甲醛/甲醇：在3% 甲醛溶液中室温固定 15 分钟，之后在 -20°C 的温度下在甲醇溶液中固定 5 分钟（转移过程中不要冲洗）。立即进行染色（D 部分）。

D. 染色

1. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。

2. 在甲醇/过氧化物酶中室温孵育 10 分钟。

3. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。

4. 在每个切片上滴加 100–400 µL封闭液，在室温下封闭 1 小时。

5. 清除封闭液，然后每个切片加入用封闭液稀释的 100–400 µL的一抗。

6. 4°C 孵育过夜。

7. 将DAB 平衡至室温。

8. 清除抗体溶液，在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

9. 根据需要，滴入适量DAB。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。

10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

11. 在每张切片上应用 100–400 µL DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟可得到合适的染色强度。

12. 将切片浸入 dH2O 中。

13. 如有需要，可根据制造商的说明使用苏木精对切片进行复染。

14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

15. 使切片脱水：

a. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。

b. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。

c. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。

d. 用盖玻片盖住切片。

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