5-FAM Dibenzocyclooctyne（CAS号1384485-04-4，5-羧基荧光素二苯并环辛炔）是一种集荧光成像功能与生物正交反应活性于一体的探针，其分子结构由荧光报告基团（5-羧基荧光素，5-FAM）、生物正交反应基团（二苯并环辛炔，DBCO）和连接臂组成。5-羧基荧光素是荧光素的衍生物，在荧光素的5位引入羧基官能团，既保留了荧光素高荧光量子产率（约0.90）、高荧光亮度的优点，又通过羧基实现了与DBCO基团的稳定连接；其最大吸收波长约为492 nm，最大发射波长约为518 nm，属于可见光荧光染料，可通过常规荧光显微镜、流式细胞仪等普及型设备进行检测。DBCO基团作为生物正交反应的经典基团，能够与叠氮基团发生无催化剂的SPAAC反应，反应特异性强、条件温和，在生物体内复杂环境中可快速完成标记，无副反应干扰。两者通过酰胺键连接，形成稳定的分子结构，确保荧光性能和反应活性的协同发挥。
理化性质方面，5-FAM Dibenzocyclooctyne的荧光性能优异，荧光量子产率高达0.88，荧光亮度强，检测灵敏度高，能够实现对低丰度靶标分子的检测。在溶解性方面，由于5-FAM母核具有一定的疏水性，该化合物在纯水中的溶解度较低（约0.3 mg/mL），但在DMSO、DMF等有机溶剂中溶解度较高（可达15 mg/mL），在含5-10% DMSO的生理盐溶液中，可稳定溶解并保持良好的荧光性能和反应活性。其化学稳定性良好，在pH 5.0-9.0的范围内，荧光强度波动不超过5%，DBCO基团的反应活性无明显衰减；在室温下避光储存6个月后，HPLC纯度仍可达95%以上。细胞毒性方面，该化合物表现出低毒性特征，在常规实验浓度（1-5 μM）下，对HeLa、HEK293、HUVEC等多种细胞系的存活率无明显影响，能够满足细胞内标记和成像实验的需求。需要注意的是，5-FAM母核对光较为敏感，在强光照射下易发生光漂白，因此在实验过程中需严格避光操作，尤其是在荧光成像阶段，以保证荧光信号的稳定检测。
合成工艺上，5-FAM Dibenzocyclooctyne的制备核心是实现5-FAM与DBCO的高效、特异性酰胺化反应，常用的合成路线为：第一步，以5-羧基荧光素（5-FAM）为原料，在缩合剂（如EDC、NHS）的作用下，将羧基活化为琥珀酰亚胺酯活性中间体，提高其与氨基的反应活性，活化反应需在无水有机溶剂（如DCM、DMF）中进行，避免水分导致活化中间体水解；第二步，将活化后的5-FAM与氨基修饰的DBCO（如DBCO-乙二胺）在碱性条件（pH 7.5-8.0）下进行酰胺化反应，通过酰胺键将5-FAM与DBCO共价连接，反应过程中需控制温度在室温，避免高温导致荧光素母核结构破坏；第三步，采用柱层析（硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇混合体系）和高效液相色谱（HPLC）进行纯化，去除未反应的5-FAM、DBCO-乙二胺、活化剂和副产物，最终得到高纯度（HPLC纯度≥98%）的目标产物，其CAS号为1384485-04-4。整个合成过程的关键在于控制活化反应的效率和酰胺化反应的选择性，避免5-FAM的多活化或DBCO的自身聚合，合成产率约为35-45%，主要受活化中间体的纯度和反应条件的控制。
