ELISA检测特异性提高的方法

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种依赖抗原-抗体特异性结合的检测技术，广泛应用于疾病诊断、生物标志物检测等领域。然而，由于样本复杂性或试剂设计不当，可能出现非特异性结合或交叉反应，导致假阳性或背景信号升高。因此，提升ELISA检测特异性是确保结果可靠的关键。

以下是从抗体、样本、操作到试剂盒设计等多个维度总结的有效策略，并附有对比表格帮助快速掌握关键点。

提升特异性的核心方法

1、选用高特异性抗体

优先使用经过验证的单克隆抗体，因其仅识别单一表位，减少交叉反应风险。

在双抗体夹心法中，包被抗体与标记抗体应针对抗原的不同表位，避免竞争性结合。

2、优化封闭条件

使用5%脱脂奶粉或0.8%明胶作为封闭剂，有效阻断非特异性结合位点。

若样本含高浓度杂蛋白，可在封闭液中添加0.05% Tween-20进一步降低背景信号。

3、改进洗涤流程

增加洗涤次数至5–6次，每次静置30秒，充分去除未结合成分。

洗涤液中加入0.05% Tween-20可增强去除非特异性吸附的效果。

4、优化抗原制备方法

采用三氯乙酸（TCA）沉淀法处理抗原，可去除低分子量非特异性成分（如LOSs），保留目标蛋白并提高ELISA特异性。

研究显示，TCA处理后交叉反应率低于10%，显著优于未经处理的抗原。

5、合理选择ELISA类型

大分子抗原推荐使用双抗体夹心法，因其具有更高的特异性；

小分子物质（如激素）则适用竞争法ELISA。

6、样本预处理与验证

高浓度样本需稀释以避免钩状效应（Hook Effect）。

通过回收率试验和交叉反应测试验证试剂盒特异性，要求交叉反应率<5%。

特别说明：TCA沉淀不仅能去除部分脂寡糖（LOSs）等干扰性低分子物质，还能保留主要抗原蛋白结构，从而在不牺牲灵敏度的前提下提升特异性。

建议

为系统提升ELISA检测特异性，建议采取“三步走”策略：

前期准备：选用经验证的高特异性抗体对和优质试剂盒（如南京博研生物等品牌）；

过程控制：严格执行封闭、洗涤与孵育规范，并设置阴性/阳性对照监控实验质量；

后期验证：开展回收率试验、交叉反应测试，并结合Western Blot等方法验证关键结果。

同时，定期校准移液器和酶标仪，确保设备精度，也是维持批间一致性和ELISA检测特异性的必要措施。