ELISA微量样本的处理方法

在科研实验中，尤其是使用小鼠等小型动物时，血液总量有限（成年小鼠循环血量约1.5–2.5 mL），传统ELISA试剂盒需100 μL样本/次检测，严重限制了可测指标数量。为解决这一问题，微量样本ELISA技术应运而生，部分产品仅需10–25 μL样本即可完成检测，极大提升了样本利用率和实验可重复性。

以下是处理微量样本的一些建议：

一、样本收集：

血液样本：使用微量采血管或离心管，避免溶血。对于血清，允许血液自然凝固，或在室温静置30-60分钟，然后以1000-3000xg离心10-20分钟收集上清。对于血浆，立即加入抗凝剂（如EDTA、肝素或枸橼酸钠），并在采集后的30分钟内以1000-3000xg离心15分钟，收集上清。

尿液或其他体液：离心20分钟，以1000xg去除不溶性颗粒。

二、样本预处理优化

‌微量样本处理‌：采用高灵敏度裂解液（如RIPA），按1:5-1:10比例稀释样本（如10mg组织加50-100μL裂解液），冰上匀浆后13000rpm离心10分钟。

‌减少损耗‌：使用预冷PBS冲洗组织，避免残留血液干扰；分装后-80℃保存，避免反复冻融。

三、样本保存：

短期保存：在2-8°C冰箱内，避免反复冻融。

长期保存：分装后置于-20°C或-80°C，避免反复冻融，因为这可能导致蛋白质变性和降解。

四、样本使用：

稀释：根据试剂盒建议，可能需要将样本稀释至特定浓度，以确保其在检测范围内。稀释时应使用无血清培养基、PBS或其他推荐的稀释液。

浓度调整：如果目标物浓度未知或预期过高，应先进行初步检测或通过标准曲线确定适当的稀释比例。

五、加样操作优化：

‌精准加样‌：使用微量加样器（如10-100μL规格），垂直加样至孔底，避免气泡产生。

‌防污染‌：每份样本更换吸头，加样后振荡混匀（如300rpm震荡5秒）。

六、注意事项：

避免污染：使用无热原、无内毒素的试管或离心管，确保所有操作在无菌条件下进行。

蛋白酶抑制剂：在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，保护目标蛋白不被降解。

样本量：确保有足够的样本进行多次重复检测，以提高结果的可靠性。

建议：

1、优先分装保存：无论样本多少，均应分装冻存于-80℃，严禁反复冻融，以防蛋白变性。

2、选用微量检测平台：若样本极其珍贵，推荐采用微流控或MSD电化学发光平台，节省样本同时提升灵敏度。

3、预实验验证稀释倍数：微量样本常需浓缩或调整稀释比例，建议先用少量样本做系列稀释，确保结果落在标准曲线线性范围内。

通过以上步骤，可以有效地处理微量样本，确保ELISA实验的准确性和重复性。