提取纯化大黄素的工艺研究

大黄素(emodin)为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L．和虎杖Polygonum cuspidatum Sieb．et Zuce．的有效成分之一，在正品大黄和虎杖的游离蒽醌衍生物中占的比例较大，其化学名为1，3，8一三羟基一6甲基蒽醌(1，3，8一trihydroxy一6一methy lanthraquinone)，分子量为270．23。大黄素对消化系统、泌尿系统、心血管系统等具有广泛的药理作用，同时还有抗肿瘤、抗病毒等作用 J。本实验室所研究的抗病毒药物正是以大黄素为主要组成成分 J，并且前期毒性试验结果显示不同提取工艺得到的提取物的生理毒性不同 J，为了动物实验结果的稳定可靠，本文对大黄素的提取工艺进行研究，选择其的提取工艺，并建立质量标准，为进一步实验提供科学的依据。

1 仪器与材料

1．1 药材

虎杖饮片购于湖北省药材公司，经湖北中医学院陈科力教授鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum c 一 pidatum Sieb．et Zuce．的干燥根

1．2 仪器试剂

p680高效液相色谱仪(德国戴安)，UVD170U 检测器(德国戴安)，HKZJZ一830171 BAF高效液相数据处理系统(戴安变色龙)，BP一21lD型十万分之一分析天平(Mettler Toledo公司)，大黄素标准品 (中国药品生物制品检定所批号110756—200110) 色谱纯乙腈(安捷伦公司)，水为超纯水，其他试剂为分析纯

1．3 色谱条件

色谱柱：ZORBA×SB—C18(安捷伦公司)，流动相：乙腈一0．1％磷酸(80：20) 柱温：40~C；流速：1．0 ml·min～；检测波长： 254 llm；灵敏度：0．08 AUFS

2 方法与结果

2．1 标准曲线的绘制

2．1．1标准品溶液的制备精密称取大黄素标准品 4．3 mg于50 mL量瓶中，加入适量甲醇超声溶解并定容至刻度，配成0．086 g·L 的对照品溶液。

2．1．2标准曲线的制备精密量取大黄素标准品溶液 0．2 mL、0．3 mL、0．4 mL、0．5 mL、0．6 mL于2 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配成0．0086 g·L～、 0．0129 g ·L～ 、0．0172 g ·L～ 、0．0215 g ·L～ 、 0．0258 g·L 5种浓度，按照上述色谱条件，分别进样20 测定。以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标绘制标准曲线，见表1和图1，回归方程为Y=49．61 X一2056．05(r=0．9986)，结果表明大黄素在0．0086 g · L～～0。0258 g·L 范围内呈良好的线性关系。

2．2 正交买验

2．2．1正交设计方案分别称取粉碎过20目筛后的干燥虎杖药材50 g 9份，以乙醇体积分数、乙醇用量、提取次数、提取时间为四因素，各取三水平做正交试验(见表2)，每组试验均进行提取，趁热滤过，回收乙醇至无醇味，加水至500 mL，静置过夜，过滤，再加水至500 mL，静置2 h，过滤，以pH=4的80％乙醇：丙酮(1：1)混合溶液500 mL溶解，40度超声30 min，然后过滤，滤液回收，干燥物以体积分数95％乙醇溶解，有黄色沉淀析出，离心，干燥，精密称取一定量定容，测定大黄素量，以大黄素的含量为考察指标，确定提取工艺。

2．2．2正交实验结果

正交实验结果见表3、4 直观分析表中极差值大小显示，各因素作用主次为A>C>B>D，方差分析结果表明：A因素的影响具有显著性意义，B 与B ，D 与D 差别不大，考虑生产成本与缩短生产周期，取B 、D 。因此，优选组合为A B C D 。即体积分数85％乙醇提取3次，每次8倍量溶剂，提取1．5 h。

2．2．3验证实验分别称取粉碎过20目筛后的干燥虎杖药材50 g 3份，按照上述正交实验的优选条件，体积分数85％乙醇提取3次，每次8倍量溶剂，提取1．5 h，测定大黄素的含量，结果见表5，说明该工艺稳定。

2．3 样品的含量测定

取干燥粉碎过20目筛后的虎杖药材50g，体积分数85％乙醇回流提取3次，每次8倍量乙醇，每次提取1．5 h。回收乙醇后得浸膏，加水至500 mL，静置过夜，过滤，再加水至500 mL，静置2 h，过滤，以pH=4的体积分数80％ 乙醇：丙酮(1：1)混合溶液500 mL溶解，40度超声30 min，然后过滤，滤液回收，干燥物以体积分数95％乙醇溶解，过滤，沉淀干燥，精密称取一定量干燥提取物，用甲醇超声溶解定容至10 mL容量瓶中，0．45 m滤膜过滤，续滤液按色谱条件，进样20 L，测定大黄素的峰面积，用外标法代人线性回归方程，计算虎杖药材中大黄素 的质量分数，结果见图2、3和表6。由表6可知，本品中大黄素的平均质量分数为11．49％ ，平均纯度为71．9％ ，故规定每克虎杖药材中大黄素的含量不得低于10．00％ ，提取物的纯度不低于70％ 。
 

3 讨论

本实验室长期进行大黄素的提取纯化工艺的研究，现在已经可以得到比较纯的化合物。在前期的细胞实验中所用的大黄素均为本实验室提取纯化的，质量分数可达95％ 以上，这种纯度进行细胞实验非常合适，但是在动物实验中发现其毒性较大。改变提取工艺后，纯度降低到70％，但是动物毒性大大降低，而疗效却没有改变，所以对大黄素提取工艺进行改进是非常必要的。

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