上海优宁维生物科技股份有限公司

来自洛克菲勒大学（Rockefeller University）和纽约干细胞研究所等机构的研究人员研究人员Dominik Paquet及其同事首次尝试利用CRISPR-Cas9技术在细胞中插入两种遗传突变，而这两种遗传突变和引发阿尔兹海默氏症疾病的β淀粉样蛋白的产生直接相关，随后研究者发现，这种方法的成功率较低，仅有一小部分细胞会携带上理想的基因突变。主要的问题就是CRISPR-Cas9可以持续切割细胞的DNA，而细胞的自身修复细胞会不断修复每一个切割处直到细胞产生一种可以抑制切割的错误，而这种错误一旦产生就会在细胞中不断产生很多新型未知的问题。

随后科学家们评估了另外一种方法，即引入大块的突变来抑制后期的切割现象，通过在CRISPR-Cas9靶向检测的DNA不同部位中引入大块突变后，研究者发现这可以明显减少意外错误产生的数量。当研究人员利用CRISPR-Cas9引入阿尔兹海默氏症的任意一种遗传突变后，他们仔细观察遗传序列后发现了一种特殊的模式，也就是说在CRISPR-Cas9切割位点和研究者引入受体细胞的突变之间存在一段序列上的距离。

随后研究者Kwart说道，序列距离较短会产生出更易于包含两种突变的细胞，而随着距离增加，编辑的成功率就会降低，而一种突变的比率和其原始基因版本的峰值之间的距离就会开始拉大；更为重要的是研究者发现了特殊的距离关系，这样他们就有可能制造出大量的杂合细胞；而利用上述技术研究人员就可以对干细胞的基因组进行编辑使细胞包含两种阿尔兹海默氏症基因中的任意一种，随后诱导这些干细胞转化成为神经元细胞并且产生大量β淀粉样蛋白，从而模拟阿尔兹海默氏症的疾病表现。

此前并没有简单的方法来控制确定是否通过CRISPR-Cas9技术编辑就可以产生和特殊疾病表现相关的杂合突变，而此研究中，研究者通过对上述距离关系特性的分析就成功实现了利用基于CRISPR的技术在细胞中重现疾病症状的目的。（生物谷Bioon.com）

Nature发布的9月1日封面文章“The antibody aducanumab reduces Aβ plaques in Alzheimer's disease”，让百健公司用于治疗阿尔兹海默症的药物aducanumab成为聚焦点。根据初步的临床试验结果，该实验性药物能够清除轻度阿尔茨海默病患者大脑中的蛋白堆积和延缓他们的精神衰退。时隔仅仅一天，百健公司宣布，该药物已经获得了美国FDA加速审批待遇。这也意味着aducanumab的开发即将行驶上快车道。

在这项临床试验中，aducanumab在165名轻度阿尔茨海默病患者体内开展为期一年的测试。一些患者每月接受这种抗体的注射，而其他的患者每月服用安慰剂。

在其临床一期，随机、双盲、安慰剂对照单次递增剂量研究调查了阿杜那单抗在轻中度AD患者中的安全性、耐受性和药代动力学（PK）。符合条件的患者按6:2顺序随机分为阿杜那单抗（0.3、1、3、10、20、30和60 mg/kg）或安慰剂组。
临床一期的主要结果是安全性和耐受性。剂量≤30mg/kg的耐受性良好，无严重或严重不良事件（SAEs）。接受60 mg/kg阿杜单抗治疗的所有三名患者均出现淀粉样蛋白相关影像学异常症状的严重不良事件，在第8-15周完全缓解。阿杜单抗Cmax、AUC0-last和AUCinf以剂量比例增加。
血浆中的Aβ40 and Aβ42 检测方案：使用MSD (Meso Scale Discovery)的MULTI-SPOT Human/Rodent (4G8) Abeta Triplex Ultra-Sensitive Assay。

MESO SCALE DISCOVERY提供独特的，多指标免疫分析平台，以用于定量生物样本的蛋白含量。

• 超高灵敏度 fg/ml ，超宽检测范围 5-6log，降低胡克效应，提高检测稳定性

• 1000多种指标，多个物种，多种组合，100多种方法学供开发

• 开放平台：可包被ELISA抗体，WB抗体，核酸引物，悬浮细胞，多肽，病毒表面颗粒等

• 应用广泛：药物代谢，免疫原性，中和抗体，药物IC50，内源性蛋白定量，抗体亲和力，SNP单核苷酸，siRNA定量，PCR/Western Blot的替代方案，ELISA的升级方案

• 金标准：生物药物(CarT, AAV,多肽, siRNA ,重组蛋白,抗体,疫苗）的药物代谢/免疫原性

• 中检院已验证，基于细胞水平的抗体结合能力检测Cell Based Binding Assay（抗体靶向结合检测，抗体鉴定，如PD-L1, PD-1, ADC）

• 多指标高通量检测：肿瘤免疫111 因子，神经炎症40因子，代谢87因子，促炎10因子

• 磷酸化蛋白信号高通量通路检测：Akt，STAT3，细胞凋亡，MAPK

定量神经病理学方法为研究和临床应用提供了重要的信息。数字病理学和图像分析的技术进步为AD的研究提供了新的解决方案，能够对病理严重性程度进行有效量化。手动检查和量化大脑不同区域的Tau 蛋白和β-淀粉样蛋白的表达是非常耗时耗力的。尽管专业的神经病理学专家在这方面拥有长期的专业知识，但评价者之间的差异性和可靠性仍不如人意，这也限制了将研究结果快速的推广到其他的机构。

所以我们将介绍HALO数字病理图像分析平台在应对阿尔兹海默症中的定量分析研究。HALO对AD的量化评估，将助于证明病变类型的密度与认知障碍的关系。

阿尔兹海默症的特征是大脑中存在具有神经毒性的 β 淀粉样蛋白沉积物。AD的病理学研究表明，体内积累的Aβ可引起Tau蛋白的过度磷酸化。此外，Tau蛋白过度磷酸化的信号转导途径可能与积累的Aβ有关。Aβ的自身紊乱，沉积形成的非纤维化斑块，可以诱导细胞凋亡、激发炎症级联反应、产生氧化应激、导致线粒体功能障碍等，从而加剧AD的病理过程。

对大脑皮质区域进行标注后，使用HALO Tissue Classifier算法对皮质区域内淀粉样斑块进行识别，并计算DAB阳性染色区域的占比（图1）。

使用HALO Object Colocalization模块，可准确识别全组织切片内淀粉样斑块的数量、密度、最小及直径、淀粉样斑块的平均光密度等信息（图2）。

Tau 蛋白具有高度的可溶性，在中枢神经系统 (CNS) 和外周神经系统 (PNS) 的神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞中表达。在AD神经元中，蛋白激酶/ 蛋白磷酸酯酶磷酸化系统失衡，导致Tau蛋白异常、过度磷酸化。Tau蛋白的过度磷酸化在AD的发病过程中起着关键作用。

经过训练的病理研究人员根据细胞结构特征（神经元细胞的大小、形态和密度等细胞形态学特征），利用HALO圈注工具对大脑海马区不同区域（Entorhinal cortex (ERC)、CA2/3、CA1/Sbuiculum、CA4/Dentate gyrus (CA4/DG))进行圈注。基于HALO Area Quantification算法，通过颜色反卷积算对DAB染色和苏木素染色进行颜色拆分，确定每张切片内Tau、Aβ阳性染色区域的面积占比（图3）。

使用双重免疫荧光染色评估海马区及额叶皮质区域AP2A2和pTau蛋白的共定位情况（图4）。基于HALO Area Quantification FL算法，不仅可以快速计算AP2A2及pTau蛋白的阳性区域占比，也可快速对其共定位区域的阳性面积占比进行评估。在评估过程中，用相邻的连续切片的单一抗体染色作为对照，设置免疫染色的阳性区域阈值。算法设置好后，对所用的组织样本采用该算法进行批量处理。

Tau蛋白的存在可以增强轴突中微管的稳定性，而4R tau蛋白比3R具有更强的微管结合能力和微管稳定能力。Tau蛋白病在3R或4R tau的病理聚合物中也表现出不同的表达，并有助于进一步定义某些疾病。使用免疫荧光分析，基于 HALO AI nuclear segmentator and nuclear phenotyper算法对3R和4R Tau亚型及其在CTE和AD颞叶皮质中的差异积累进行了详细的组织学表征（图5）。

美国Indica labs提供专业领先的病理图像分析全套解决方案，包括用于图像分析的HALO®和HALO AI以及用于图像和数据合作式管理的HALO Link系统。目前正在被全球各大制药公司、生物技术、医疗健康和研究组织使用，广泛的应用于神经科学、代谢组学、肿瘤学、毒理病理学等领域的病理图像定量研究中。

在不同的分析领域，HALO提供了大量可供选择的个性化应用模块：

• 面积定量分析，一般的免疫组化和免疫荧光的胞膜、胞核、胞浆定量分析；

• 应用在肿瘤学方面的距离分析，免疫细胞浸润分析；

• DNA/RNA的原位杂交，荧光原位杂交的定量分析；

• 组织芯片微阵列分析等

• HALO平台操作简单、分析迅速、分析结果数据量巨大