还原型谷胱甘肽

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期过度酗酒引起的肝脏损伤，初期常表现为酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver disease，AFLD）、酒精性肝炎，进而可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝功能衰竭［1-2］。AFLD诱导因素为大量摄入酒精，引起肝细胞内脂质蓄积量超过肝湿质量的5%，或1/3以上肝组织每单位面积发生脂肪变性，属于ALD的早期阶段［3］。研究表明，90%重度酗酒者可发展为脂肪肝，其中30%可发展为肝纤维化，8%～20%可进展为肝硬化，ALD是肝病相关患病率及死亡率的主要原因［4］。

临床常用皮质类固醇、己酮可可碱等治疗AFLD，虽能减轻部分临床症状，但毒副作用明显、疗效个体差异大等因素严重限制了其广泛使用。有Meta分析显示，糖皮质激素可改善重症酒精性肝炎患者短期生存率，但对轻、中型病例无明显效果［5］。谷胱甘肽具有解毒、抗惊厥、抗血栓、抗氧化和抗动脉粥样硬化作用［6］。谷胱甘肽的半胱氨酸侧链具有一个活性巯基，可以保护体内蛋白酶的巯基不被氧化和破坏［7］。乙醇能够直接对各种细胞器和酶的结构和功能产生损害［8-10］，同时也能够限制线粒体脂肪酸的β氧化，导致脂质过氧化反应，进而抑制了谷胱甘肽的生物合成，继而使其抗氧化功能减弱，酒精在体内代谢可引起氧化应激和脂质过氧化反应，两者都会导致肝细胞内部分细胞器的结构发生改变，进而引起肝细胞功能的紊乱［11］。

还原性谷胱甘肽片在临床上主要用于慢性肝脏疾病的辅助治疗，包括病毒性、药物毒性、酒精毒性引起的肝脏损伤。但采用AFLD斑马鱼模型研究还原性谷胱甘肽片的治疗效果未见报道。与啮齿类动物相比，斑马鱼具有饲养经济、方便，容易获得足够的样本量，胚胎透明、便于显微镜下观察肝脏，有利于高通量药物筛选等独特优点［12-14］。与此同时，斑马鱼体内拥有代谢酒精所需的关键酶，胚胎发育第4天肝脏便开始成熟，在低剂量乙醇下暴露4周可诱导形成典型的乙醇性肝病，该模型具有病理和基因表达模式［15］。本研究利用斑马鱼模型探讨还原性谷胱甘肽片对AFLD的保肝功效，为合理指导临床用药提供参考。

1　材料

1.1　药物与主要试剂

还原型谷胱甘肽片，批号19040870，重庆药友制药有限责任公司，用标准稀释水配制成20 mmol/L母液。阳性对照：RU-21，批号25780，美国精神科学有限公司，阴凉避光保存，用超纯水配制成100 mg/mL母液，-20 ℃保存。甲基纤维素（批号079K0054V，Sigma，USA）；无水乙醇（批号20200825，国药集团化学试剂有限公司）；4%组织细胞固定液（批号20190923，Solarbio）；二甲苯（批号C10631736，上海麦克林生化科技有限公司）；PBS缓冲液（批号10C16B30，武汉博士德生物工程有限公司）；Mayer苏木素染色液（批号YH0170326）、伊红染色液（批号YH180124）、中性树脂封片剂（批号YH0170419），均购自上海依赫生物科技有限公司；软蜡（熔点54～56 ℃，批号20180108）、硬蜡（熔点62～64 ℃，批号20190628），上海华永石蜡有限公司；iTaq Universal SYBRGreen Supermix（货号1725124，Bio-rad，USA）；FastQuant RT Kit（With gDNase）试剂盒（货号KR106，TIANGEN，China）；RNA-Quick Purification Kit（RNA快速提取试剂盒）（货号RN001，YiShan Biotech，China）。

1.2　主要仪器

解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技有限公司）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；紫外-可见光分光光度计（Nanodrop2000，Thermo，USA）；PCR仪（T100，BIO-RAD，USA）；实时荧光定量PCR仪（CFX Connect，BIO-RAD，USA）；高速冷冻离心机（PIC017/21，Thermo，USA）。

1.3　实验动物

黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼，以自然成对交配方式进行繁殖，共1 020尾，日龄为受精后5 d（5 dpf），均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每升反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 µS/cm；pH值为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO3），来源和饲养于杭州环特生物科技股份有限公司，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号001458）的要求。

2　方法

2.1　还原型谷胱甘肽片耐受浓度（MTC）测定

基于文献研究［16-17］，采用2%酒精诱导32 h，构建斑马鱼幼鱼AFLD模型。斑马鱼幼鱼形态学出现严重改变，如游动兴奋异常，出现转圈乱窜，呈现心包水肿，脊柱弯曲，卵黄囊水肿以及鱼鳔畸形等，但没有观察到死亡现象。

随机选取210尾5 dpf 黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼于六孔板中，每孔均30尾，分别水溶给予还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000、4 000、8 000 µmol/L，同时设置对照组和模型组，每孔体积3 mL。除对照组外，其余组均给药同时用2%乙醇诱导斑马鱼32 h建立AFLD模型，观察记录斑马鱼的死亡情况及表型，确定还原型谷胱甘肽片对AFLD模型斑马鱼的MTC。

2.2　还原型谷胱甘肽片保肝功效评价

随机选取180尾5 dpf黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾。分别水溶给予还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L，阳性对照药RU-21 100 µg/mL，同时设置对照组和模型组，每孔体积3 mL。除对照组外，其余实验组均用2%无水乙醇诱导斑马鱼建立AFLD模型，28 ℃处理32 h后，用油红O进行染色，染色后每组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，使用NIS-Elements D3.20高级图像处理软件分析统计斑马鱼肝脏脂肪染色强度（S），保肝功效计算公式如下：

保肝功效＝（S模型－S还原型谷胱甘肽片）/（S模型－S对照）

2.3　还原型谷胱甘肽片对斑马鱼肝脏组织病理学的影响

斑马鱼给药及造模同“2.2”项，用4%组织细胞固定液固定斑马鱼，进行HE染色（固定-脱水-包埋-切片-染色），并进行病理学分析评价还原型谷胱甘肽片保肝功效。