汇智和源生物技术(苏州)有限公司

Keywords：Microsomes, Phase Ⅱ Metabolism; Hepatocytes; UDPGA; UGT; Drug Metabolism; Phase Ⅰ Metabolism
药物代谢（Drug Metabolism）研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体（Liver Microsomes）体外温孵法、重组P450酶（Recombinant P450 Enzyme）体外温孵法、肝细胞（Hepatocytes）体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体与肝细胞体外温孵法较其它方法而言，制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。
一、药物的Ⅱ相代谢反应
药物代谢是指药物在体内发生的化学变化，导致药物结构发生改变，也被称为药物在体内的生物转化。肝脏是药物代谢的主要器官，药物在肝内药物代谢酶的作用下经过不同程度的结构变化，即I相代谢反应（Phase I Metabolism）和II相代谢反应（Phase II Metabolism）。其中，Ⅱ相代谢（Phase Ⅱ Metabolism），又称结合反应，指Ⅰ相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）结合或经甲基化、乙酰化排出体外。药物的结合反应，常常使其转化为无活性的代谢物，且极性增加，以便药物排出体外。

在药物的Ⅱ相代谢中，葡萄糖醛酸结合反应是体内生物转化最重要、最普遍的结合反应，而该类型的发生通常需UGT来介导。UGT家族是人体内仅次于CYP450家族的第2大药物代谢酶。UGT催化的葡萄糖醛酸化代谢反应是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的供体将一分子的葡萄糖醛酸转移到含有羟基、羧基、氨基、巯基以及酸性碳原子等基团的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的结合使这些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，进而更容易被排出体外。

                                     葡萄糖醛酸结合反应

UGT介导的葡萄糖醛酸结合代谢不仅会显著影响药物的口服生物利用度和药物的体内药动学过程，同时还与一些临床药物-药物相互作用、药物-草药相互作用、药物-食物相互作用，以及高胆红素血症、癌症、自身免疫性肝炎等多种疾病的发生发展密切相关。因此，合理的体外代谢模型于研究药物的二相代谢反应具有重要意义。目前，常使用的体外代谢模型有肝微粒体（Liver Microsomes）和肝细胞（Hepatocytes）两种。
二、肝微粒体体外温孵法
微粒体（Microsomes）是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能，广泛存在于肝脏等多个器官中，主要为I相细胞色素CYP450酶（Cytochrome P450）和II相酶系UGT等，囊括了多种类型药物的不同代谢途径。
2.1肝微粒体体外孵育体系的建立

Ⅱ相代谢稳定性（Phase II Metabolic Stability）研究的肝微粒体体外孵育体系，是由肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。
推荐的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液（0.1M PBS），NADPH再生系统（1.3mM NADP，3.3mM的6-磷酸葡萄糖，0.4U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁，0.05mM 柠檬酸钠），UGT孵育系统（5mM UDPGA，5mM D-葡萄糖二酸-1.4-内酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.1 mg/mL~1 mg/mL肝微粒体蛋白，合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育。每个样品平行3次，将待测物换为7-羟基香豆素，作为阳性对照；阴性对照组分三组：a.只加UDPGA；b.不加UDPGA，用0.1M PBS缓冲液替代，理论上不代谢；c. 只包含受试物和0.1M PBS缓冲液。于预设的反应时间点，如0,2,5,10,15,30,60 min后加入等体积预冷的乙腈终止反应。

2.2 IPHASE肝微粒体II相代谢稳定性研究

为验证孵育体系的适用性，IPHASE以蛋白浓度为0.5mg/ml 的lot number 为23H018猴肝微粒体为体外孵育模型，验证终浓度为100μM的阳性药物7-羟基香豆素在体外的稳定性，并利用色谱峰面积作为计算数据。即通过时间点占初始点百分比的回归曲线计算确定化合物体外的半衰期。将受试物的零时浓度作为100%，2,5,10和30min各时间点浓度与零时浓度相比得剩余百分数，各时间点的底物剩余百分数的自然对数与孵育时间经线性回归，最终求得斜率k。最终再由计算公式可进一步得到半衰期和清除率结果。

整个孵育体系如下：

结果如下：

半衰期=5.49 min，清除率=1263 uL/mg/min

除微粒体外，亚细胞结构S9和胞质液也常用于药物的代谢轮廓研究。前者包含了完整的I相和Ⅱ相代谢酶的活性其孵育体系类似于微粒体，但其CYP450酶和UGT酶的纯度较微粒体而言略低，因此S9可用于非主要酶系代谢的体外研究模型之一；后者包含了可溶性的Ⅱ相代谢酶，如NAT、GST、ST、TPMT等，在很多化疗药物的激活与解毒过程中发挥重要作用，由于该体系中只有Ⅱ相代谢酶存在，且相对于肝S9来讲酶活还很高，因此可通过加入不同的辅酶来单独研究某个亚型酶的代谢。

三、肝细胞体外温孵法
除了肝微粒体，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）也是II相代谢稳定性试验研究的常用体外模型工具之一。相较于肝微粒体这类亚细胞结果，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）具有完整的细胞特性和生理水平的酶和辅助因子，既包括膜结合酶【如细胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，为滑面内质网中的还原酶】，也包括胞质酯酶，拥有肝脏中所有的代谢途径。因此，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）被广泛认为是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的青睐。

鉴于此，IPHASE用Lot number为K0125A051的小鼠原代肝细胞进行体外肝细胞孵育体系的验证。IPHASE技术人员将细胞密度为0.5 million cells/mL的肝细胞同终浓度为1uM的阳性药物米达唑仑共同孵育，于37℃、5% CO2培养箱中分别培育0、5、30min下药物的剩余量，由此得出药物的半衰期及清除率，符合IPHASE长久以来积累的历史数据范围值。因此，IPHASE原代肝细胞具有活性高、批次间稳定性差异小及纯度高等优势！
结果为：

半衰期=5.11 min
清除率=271 uL/mg/min

综上所述，II相代谢稳定性试验研究在药物研发中至关重要，可帮助评估代谢途径、预测清除率、优化药物设计、评估相互作用、支持临床试验、确保安全性，并满足法规要求，因此，选择合适的产品及体外孵育系统对该试验研究至关重要！

四、IPHASE产品
因此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，为满足不同客户的需求，深耕细作，研发生产出多种属、多品系的肝微粒体和肝S9，并提供相应II相代谢稳定性研究的配套试剂，并严格质控，致力于为客户提供最优质的产品。

IPHASE生产产品均具有以下优势：
合规性 生产产品的组织均由正规渠道获得，来源清晰。 
安全性 生产组织均经过病原检测，保证产品质量安全。
高质量 生产产品均经过严格的内部质控，且同批次数量多，批次间差异性小。
可定制 可根据客户特殊需求，提供特殊种属、特殊组织产品的定制服务。
高服务 高质量的售后服务，为试验顺利保驾护航。
IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品，望广大科研工作者来电咨询，咨询热线400-127-6686。

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