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膜片钳技术的发展历史

1976 年，在德国马普生物物理化学研究所，Neher 和 Sakmann 在青蛙肌细胞上进行了一项具有开创性的实验。他们使用双电极钳制膜电位的同时，成功记录到了 ACh 激活的单通道离子电流，由此，膜片钳技术应运而生。这一创举如同在细胞电生理领域点亮了一盏明灯，为后续研究开辟了全新的道路。

时间来到 1980 年，Sigworth 等人在该技术上取得了重大突破。他们在记录电极内施加 5 - 50 cmH₂O 的负压吸引，实现了 10 - 100GΩ 的高阻封接（Giga - seal）。这一成果意义非凡，它极大地降低了记录时的噪声，使得单根电极既能钳制膜片电位，又能记录单通道电流，打破了以往的技术局限。

1981 年，Hamill 和 Neher 等对膜片钳技术进一步改进。他们引入了膜片游离技术和全细胞记录技术，让这一技术更加完善。改进后的技术具备了令人惊叹的分辨率，包括 1pA 的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和 10μs 的时间分辨率，为深入研究细胞电生理特性提供了强有力的工具。

1983 年 10 月，《Single - Channel Recording》一书的问世，成为了膜片钳技术发展历程中的一座里程碑。Sakmann 和 Neher 也因其卓越的工作和突出贡献，在 1991 年荣获诺贝尔医学和生理学奖，这一荣誉实至名归，是对他们在膜片钳技术领域开创性工作的高度认可。

膜片钳技术的基本原理与特点

膜片钳技术在本质上属于电压钳范畴，但它与传统电压钳有着显著区别。一方面，二者固定膜电位的方法不同；另一方面，它们固定电位的细胞膜面积不同，这也导致所研究的离子通道数目存在差异。

电压钳技术主要是通过维持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以此来观察在不同膜电位条件下的膜电流情况。这种技术适用于研究整个细胞膜或大块细胞膜上所有离子通道的活动，在巨大细胞的全性能电流研究中有着重要应用，尤其是在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定方面，发挥着不可替代的作用。然而，电压钳技术也存在明显缺陷，它需要在细胞内插入两个电极，这对细胞损伤较大，对于小细胞（如中枢神经元）而言，这种方法很难实现。而且由于细胞形态复杂，很难保证细胞膜各处生物特性的一致。

膜片钳技术则巧妙地利用了负反馈电子线路，将微电极尖端吸附的仅几个平方微米的细胞膜电位固定在特定水平，从而能够对通过通道的微小离子电流进行动态或静态观察，进而研究其功能。在膜片钳技术中，形成高阻密封是实现膜电流固定的关键步骤，这个密封在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间产生，其阻抗数值可达 10 - 100GΩ（此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻）。由于这个阻值极高，近乎绝缘，其上的电流可视为零。形成高阻密封的力包括氢键、范德华力、盐键等。这种密封不仅在电学上接近绝缘，在机械上也相当牢固。同时，由于玻璃微电极尖端管径很小，其下方的膜面积仅约 1μm²，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，从这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来说极少，可以忽略不计。也就是说，电极下的离子电流对整个细胞的静息电位影响微小，只要保持电极内电位不变，电极下那一小片细胞膜两侧的电位差就保持不变，从而实现电位固定。

此外，高阻封接技术还显著降低了电流记录的背景噪声，极大地提高了时间、空间及电流分辨率，时间分辨率可达 10μs、空间分辨率可达 1 平方微米、电流分辨率可达 10⁻¹²A。影响电流记录分辨率的背景噪声除了来自膜片钳放大器本身外，最主要的还是信号源的热噪声。根据公式 σn = 4Kt△f/R（其中 σn 为电流的均方差根，K 为波尔兹曼常数，t 为绝对温度，△f 为测量带宽，R 为电阻值）可知，要获得低噪声的电流记录，信号源的内阻必须非常高。例如，在 1kHz 带宽、10% 精度的条件下，记录 1pA 的电流，信号源内阻应为 2GΩ 以上。电压钳技术由于只能测量内阻通常在 100kΩ - 50MΩ 的大细胞的电流，无法通过常规技术和制备达到如此高的分辨率。

膜片钳记录的几种形式

高阻封接问题的成功解决，不仅改善了电流记录性能，还催生出了多种用于研究通道电流的膜片钳方式。根据不同的研究目的，可以制成不同的膜片构型。

1.细胞吸附膜片（cell - attached patch）：将经过两次拉制和加热抛光处理的微管电极放置在清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，这样就在细胞膜表面隔离出一小片膜。随后通过微管电极对膜片进行电压钳制，能够高分辨率地测量膜电流，这就是细胞贴附膜片，也称为细胞膜上的膜片记录。由于这种方式不破坏细胞的完整性，此时跨膜电位由玻管固定电位和细胞电位共同决定。因此，为了测定膜片两侧的电位，需要先测定细胞膜电位，然后从该电位中减去玻管电位。从膜片的通道活动角度来看，这种形式的膜片非常稳定，因为细胞骨架及相关代谢过程保持完整，受到的干扰较小。

2.内面向外膜片（inside - out patch）：在高阻封接形成后，轻轻提起微管电极，使其与细胞分离，此时电极端会形成一个密封小泡。将这个小泡在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再放回溶液中，就得到了 “内面向外” 膜片。在这种情况下，膜片两侧的膜电位由固定电位和电压脉冲控制，浴槽电位为地电位，膜电位等于玻管电位的负值。如果放大器的电流监视器输出是非反向的，那么输出将与膜电流（Im）的负值相等。

3.外面向外膜片（out - side patch）：高阻封接形成后，继续用负压抽吸，使膜片破裂，然后将玻管慢慢地从细胞表面垂直提起，断端游离部分会自行融合成脂质双层，此时高阻封接仍然存在，而膜的外侧面接触浴槽液。对于这种膜片形式，需要测量膜片电阻，并消除漏电流和电容电流，整个过程要注意是否形成囊泡。如果浴槽保持地电位水平，膜电位就与玻管电位相等。若放大器是非反向的，放大器的输出将与 Im 值相等。

4.全细胞记录构型（whole - cell recording）：高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，且与浴槽液绝缘，这种形式就是 “全细胞” 记录。它既可以记录膜电位，也可以记录膜电流。其中膜电位可以在电流钳情况下记录，或者将玻管连接到标准高阻微电极放大器上进行记录。在电压钳条件下，记录到的大细胞全细胞电流可达 nA 级。在全细胞钳时，需要对串联电阻（玻管和细胞内部之间的电阻）进行补偿，因为任何流经膜的电流都会流经这个电阻，所引起的电压降会使玻管电压不同于细胞内的真正电位，而且电流越大，越需要对串联电阻进行补偿。全细胞钳还需要注意细胞大小要合理，保证其电流能被放大器检测到（25 - 50nA），减少串联电阻的方法是使玻管尖比单通道记录时大。

膜片钳技术的应用

膜片钳技术自诞生以来，不断发展，如今已成为现代细胞电生理研究的常规方法，在基础生物医学研究和临床医学研究中都有着不可或缺的地位。

目前，膜片钳技术在多个学科领域都有广泛应用，包括神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等。随着全自动膜片钳技术（Automatic patchclamp technology）的出现，膜片钳技术凭借其自动化、高通量的特性，在药物研发和药物筛选领域展现出了强大的生命力。

1.膜片钳在通道研究中的关键作用：膜片钳技术为离子通道研究提供了独特的视角。它能够直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程，清晰地区分离子通道的离子选择性，还能帮助发现新的离子通道及亚型。在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上，进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，并且可以研究胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时，该技术在研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制方面也发挥着重要作用。结合分子克隆和定点突变技术，膜片钳技术还可用于探究离子通道分子结构与生物学功能之间的关系。

此外，膜片钳技术在药物在其靶受体上作用位点的分析方面也有出色表现。以神经元烟碱受体为例，它是一种配体门控性离子通道，通过膜片钳全细胞记录技术记录烟碱诱发电流，能够直观地呈现神经元烟碱受体活动的全过程，包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力、离子通道开放和关闭的动力学特征以及受体的失敏等活动。利用该技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响，可以确定其作用的动力学特征。再根据分析拮抗剂对受体失敏的影响、拮抗剂的作用是否有电压依赖性、使用依赖性等特点，就能从功能上区分拮抗剂在烟碱受体上的不同作用位点，判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点、离子通道还是其他变构位点上。

2.与药物作用有关的心肌离子通道：心肌细胞正常功能的维持依赖于各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的调控。近年来，国外学者在人类心肌细胞离子通道特性研究方面取得了诸多进展，这使得心肌药理学实验从动物细胞模型向人心肌细胞模型转变成为可能，为深入研究心肌相关疾病和药物作用机制提供了更精准的方向。

3.对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究：通过对不同生理或病理状态下细胞膜上某种离子通道特性的研究，可以深入了解该离子的生理意义以及在疾病过程中的作用机制。例如，在对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究中发现，在缺血性脑损害过程中，Ca²⁺介导现象起着至关重要的作用。缺血缺氧会使 Ca²⁺通道开放，过多的 Ca²⁺进入细胞内，导致 Ca²⁺超载，进而引起神经元及细胞膜损害、膜转运功能障碍，严重情况下可使神经元坏死。

4.对单细胞形态与功能关系的研究：将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链反应技术相结合，在全细胞膜片钳记录的同时，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，把细胞内存在的各种 mRNA 全部快速逆转录成 cDNA，再通过常规 PCR 扩增及待检的特异 mRNA 的检测，这样可以对形态相似但电活动不同的结果从分子水平进行解释，或者为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态相似但功能不同的现象提供分子层面的依据。目前，国际上掌握这种技术的实验室较少，我国北京大学神经科学研究所于 1994 年在国内率先开展了相关研究。

5.对药物作用机制的研究：在通道电流记录过程中，可以在不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，以此研究药物对通道功能的影响，从而了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是膜片钳技术应用最为广泛的领域，无论是西药药物机制的探讨，还是中药药理的研究，都有广泛应用。例如，有研究报道采用细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和 “缺血” 诱导的大鼠大脑皮层神经元 L - 型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。还有研究采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的 Wistar 大鼠心室肌细胞 L - 型钙通道有阻滞作用。

6.在心血管药理研究中的应用：膜片钳技术在心血管领域的广泛应用，使人们对血管疾病和药物作用的认识不断更新，在病因学和药理学方面形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher 和 Sadmann 的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”，膜片钳技术在心血管药理研究中的重要性不言而喻。

7.创新药物研究与高通量筛选：目前，在离子通道高通量筛选中，主要进行的是样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。近年来，分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高的特点与自动化、微量化技术相结合，产生了自动化膜片钳等新技术。

总的来说，膜片钳技术的出现取代了电压钳技术，是细胞电生理研究领域的一次重大飞跃。它让离子通道的研究从宏观层面深入到微观层面，将昔日的 “肉汤生理学（broth physiology）” 与 “闪电生理学（lightning physiology）” 在分子水平上有机结合起来，使人们对膜通道的认识焕然一新。当前，生理学、生物物理学、生物化学、分子生物学和药理学等多学科正将膜片钳技术与膜通道蛋白重组技术、同位素示踪技术、光谱技术等非电生理技术相互结合，共同对离子通道展开全面深入的研究。不少实验室已经将基因工程与膜片钳技术相结合，把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究，甚至设想将合成的通道蛋白分子植入机体，替换有缺陷和异常的通道功能，从而达到治疗的目的。

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