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肝脏作为药物暴露的主要器官，在药物的代谢和毒性过程中起着至关重要的作用。原代肝细胞（Primary Hepatocytes）具有完整的细胞特性和生理水平的酶和辅助因子，既包括膜结合酶【如细胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，为滑面内质网中的还原酶】，也包括胞质酯酶，拥有肝脏中所有的代谢途径。因此，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）被广泛认为是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的青睐。因此，本文概述了基于原代肝细胞的二维（2D）和三维（3D）培养模型及其在药物研发中的运用。

Keywords: Primary Hepatocytes, 2D Cultivation, 3D Cultivation， Organoids, Co-Culture

一、原代肝细胞分离

大多采用两步胶原酶灌注法。较小动物可通过门静脉或下腔静脉进行肝脏灌注。较大动物通过肝叶或肝节段灌注。成功分离肝细胞的几个关键因素：第一，无细胞毒性的胶原酶。第二，恰当的消化时机。消化不足和消化过度都会损害肝细胞的产量和活力。第三，良好的肝脏状况。肝细胞对缺血性损伤非常敏感。用于制备肝细胞的肝脏应迅速冷却，以降低代谢速率防止代谢性缺氧和随后的缺血。分离的原代肝细胞用于药物研究的标准：1、实验开始时活率> 80%，在整个实验过程中活率下降< 20%；2、对2-3种已知上市药物的代谢进行检测，与文献值相当；3、诱导实验中典型诱导剂如利福平应使特定酶(CYP3A4)活性增加至少3倍；4、代谢和转运体研究中，冻存肝细胞胞接种4-6 h后贴壁率>70%。

二、原代肝细胞2D培养

悬浮肝细胞（Suspension Hepatocytes）模型

拥有完整的药物代谢酶和辅助因子，可用于不同代谢清除途径的研究。然而，悬浮肝细胞(Suspension Hepatocytes)的活率和药物代谢酶活性随着体外孵育时间增加会逐渐降低，限制其孵育时间最长为4小时，一般用于估计中、高清除速率药物的清除。当清除速率小于20%时，不能准确确定清除值。传统的悬浮肝细胞体外代谢研究模型不足以使慢代谢化合物产生足够被检测到的代谢反应，所以在预测慢代谢化合物的清除率及其代谢产物方面存在局限性。可采用悬浮肝细胞接力方法（图1），孵育时间可延长至20小时甚至更长。

应用：小分子药的酶活性和代谢稳定性研究。

图1. 悬浮肝细胞接力法转移流程DRUG METAB DISPOS, 2012,40(9):1860–1865

贴壁肝细胞（Plateable Hepatocytes）模型

原代肝细胞2D培养（Primary Hepatocytes 2D Cultivation）于胶原蛋白包被的培养物表面。肝细胞呈现上皮形态，细胞核突出，常呈双核状。单一肝细胞贴壁培养的缺陷：1、细胞极性和功能发生改变；2、缺乏正常功能所需的其它相关细胞类型(即非实质细胞)；3、无法提供足够的营养和旁分泌因子以支持肝细胞执行功能(如胆汁酸和血清蛋白的生物合成)。

应用：

★评价药物-药物相互作用:包括酶诱导、酶抑制和转运体研究。首先，当药物作为诱导剂时，可导致药物代谢酶和转运体表达增加。强效诱导剂可同时上调多个基因，如苯巴比妥诱导CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9、UGT以及MRP2等多种转运蛋白。其次，不同种属肝细胞对诱导剂反应存在差异。如利福平对人和兔肝细胞是一种有效的诱导剂，但对大鼠肝细胞无诱导作用。最后，贴壁肝细胞（Plateable Hepatocytes）亚理想的铺板密度可能导致P450的基础表达降低，并人为增加诱导反应，如图3所示，贴壁肝细胞在较小铺板密度时CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的基础活性都较低，却有更强的诱导反应。因此需要健康、合适铺板密度的肝细胞来获得生理学相关的数据。

图2.冻存人肝细胞铺板密度与酶诱导的关系Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7:188-198

★肝毒性评估：光镜下观察细胞形态、液泡和脂滴的聚集以及细胞的附着/脱落等形态学变化。检测肝细胞坏死（谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和谷丙转氨酶) 和凋亡（DNA断裂）。对于细胞因子介导的细胞毒性，由于受邻近的非实质细胞如Kupffer、星状和窦状内皮细胞释放的物质调控，单一贴壁培养的肝细胞不能预测毒性反应。

★ "接力法"用于慢代谢化合物清除率及其代谢产物研究: 贴壁肝细胞药物代谢酶活性在贴壁培养24 h 后开始降低。可将贴壁肝细胞用含待测化合物的无血清培养基孵育24小时后，收集培养基混合后置于新贴壁培养的肝细胞（图3）。

图3. 贴壁肝细胞接力法转移流程Drug Metabolism Letters, 2016,10: 3-15

★评估靶向肝细胞的小核酸药的细胞摄取、内吞、内体逃逸以及对靶基因的沉默效果。

三明治培养（Sandwich Cultivation）模型

在体外通过在两层胶原或Matrigel内培养肝细胞可以重构体内结构，称为三明治培养。肝细胞培养在两层凝胶-胶原之间(夹心结构)，可改善肝细胞的形态和活力，并在培养中维持较长时间的功能。此外，三明治式培养的肝细胞可重新恢复极性，允许基底外侧和小管转运体
的适当定位以及功能性胆管网络的形成（图4）。

图4.人肝细胞三明治模型中转运蛋白的极化表达Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188-198

应用：

★估计化合物的胆道排泄。

★评估内源性和外源性化合物和代谢物的肝胆分布。

★估计代谢和转运体介导的清除，构建基于生理学的药代动力学模型。

★研究肝细胞毒性，提供临床药物性肝损伤的机制。数据整合到系统药理学模型中预测人类潜在的药物性肝损伤。

三、原代肝细胞3D培养

球状体（Spheroid）模型

通过超低粘附培养、悬滴培养、磁化细胞培养等技术（图5），原代肝细胞可不依赖外部基质，聚集形成直径高达150-175µm的球状团聚体。球状体培养的一个优点是，每个球体只需要1330-2000个细胞，与其它3D培养（3D Cultivation）技术相比显著减少。最近的一项研究表明原代肝细胞球状体培养可持续5周，CYP酶活性在第8天到第35天之间几乎没有变化。一项蛋白质组分析表明，与三明治培养相比，球形培养中负责药物吸收、分布、代谢和排泄的酶能更好地保存14天。然而，肝脏比细胞团复杂得多。肝细胞的基底外侧与血液接触，在顶端侧胆汁流出，这是复杂的肝小叶结构的主要特征，目前还不能在球状体模型中复制。

应用：

★慢代谢化合物清除率及其代谢产物研究。

★肝细胞毒性研究。

★评估靶向肝细胞的小核酸药的细胞摄取、内吞、内体逃逸以及对靶基因的沉默效果。

图5.球状体培养方法

肝类器官（Liver Organoids）模型

对类器官定义的共识是:来源于干细胞、祖细胞或分化细胞的3D结构，能够在体外再现原生组织的某些功能和结构，可有效地再现体内微环境和细胞与细胞之间的相互作用。肝类器官已被确定为人类肝脏生物学研究的最先进模型。

构建肝类器官的细胞来源：

多能干细胞(PSCs)：胚胎干细胞(ESCs)和诱导多功能干细胞(iPSCs)具有高多能性、可塑性和无限增殖能力，在特定信号转导因子的作用下分化为具有活性和功能的肝细胞样细胞。然而，PSCs诱导的肝类器官可能发生表观遗传和遗传畸变，在扩增过程中表现出染色体非整倍体改变。

应用：

★构建遗传性肝病模型

★构建感染性肝病模型

★药物细胞毒性

★移植和肝脏疾病研究。

肝组织来源细胞：包括胆管细胞和肝细胞。成熟肝细胞在特定环境中仍具有干细胞潜能和增殖能力。与PSCs诱导的类器官相比，原代组织来源的类器官更成熟，基因组更稳定，在长期体外培养过程中保持了表型和遗传稳定性。然而，与胎儿人肝细胞或成年小鼠原代肝细胞相比，成熟人肝细胞类器官的长期增殖能力有限。到目前为止，成人肝细胞类器官的培养仍然具有挑战性。

培养方法（图6）：肝组织消化成单细胞，将Matrigel/细胞混合物接种在24孔板中，以形成圆顶状结构。细胞培养箱(37℃)中孵育15分钟。凝固后加入特定培养基。大约14天后传代。7-10天后，用分化培养基替换原来的培养基。

应用：

★肝毒性模型

★体外代谢紊乱研究。

★非酒精性脂肪肝疾病

★良性和恶性肝病的药物开发

图6. 组织源性肝类器官的培养和传代过程Cell & Bioscience (2023) 13:197

球状体培养与类器官培养比较

四、原代肝细胞共培养模型

2D原代肝细胞共培养模型

将两种或两种以上不同类型的细胞混合在2D培养环境中培养。其关键特征在于不同细胞之间的直接相互作用，细胞和细胞外基质的相互作用，或者通过细胞因子、化学通讯间接传递信号。原代肝细胞功能（如白蛋白产生和药物代谢能力）可以维持长达3周。

★原代肝细胞与成纤维细胞共培养：用于慢代谢化合物清除率及其代谢产物研究。

★原代肝细胞与非实质肝细胞（星状细胞，肝窦内皮细胞）共培养：用于药物性肝损伤的研究，有助于研究细胞因子、趋化因子和生长因子在药物暴露后调节肝脏适应性反应中的作用。

★原代肝细胞与T细胞共培养：检测肝药物代谢特异性T细胞反应。

★IPHASE也开发了不同种属的原代肝细胞共培养系统HepatoMaxTM（图7），通过原代肝细胞与基质细胞共培养，可以实现人原代肝细胞在3周内保持良好的药物代谢酶活性，适用于慢代谢化合物清除率及其代谢产物研究。

图7. IPHASE人原代肝细胞共培养系统

3D原代肝细胞共培养模型

直接3D共培养：将两种或多种不同类型的肝细胞（原代肝细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞、枯否氏细胞）混合成自组装球体，或在胶原蛋白、纤维蛋白、海藻酸盐和水凝胶等构建的3D环境中共同培养。直接3D共培养可以使不同肝细胞紧密接触，通过细胞间直接黏附、可溶性细胞因子旁分泌、细胞外基质黏附等机制实现肝细胞间的信号通信。

应用：

★构建肝纤维化模型

★构建药物性肝损伤模型

★评估药物相互作用、药物代谢和酶诱导。

间接三维共培养：采用物理分离系统（Transwell或各种材料）将两种或两种以上类型的细胞（如原代肝细胞与NIH/3T3细胞或肝窦内皮细胞）在3D环境中分层培养，物理分离系统两侧的细胞之间不允许直接接触，它们之间的信号通过可溶性细胞因子进行沟通。

应用：研究非接触式肝细胞在体通信。

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