上海优宁维生物科技股份有限公司

作为生物医药科研领域的药研人，生物分析试剂盒是我们每天都要使用的必须产品，那么，您手中的形形色色的试剂盒，完全验证做好了吗？可以投入检测中吗？
在药物研发的每一个环节中，验证（validation）都扮演着至关重要的角色。无论是从实验室的初步研究到临床试验的每一个阶段，验证过程都确保了实验数据的准确性、可靠性以及最终药物的安全性和有效性。完全验证（Full Validation），则是对整个研发过程的全面保障，确保每一环节的每一个数据都经得起检验，为药物的成功上市铺平了道路。

什么是完全验证（Full Validation）？
完全验证指的是对分析方法的系统性评估，旨在确认该方法能够在预期的应用范围内提供可靠且一致的结果。这一过程通常包括对方法的特异性、灵敏度、准确性、精密度、线性范围和稳健性的全面评估。在药物研发中，完全验证不仅涵盖实验室分析方法，还延伸至生产过程中的各个环节，确保从原材料到最终产品的质量一致性。

完全验证在药物研发中的应用
1、早期研发阶段
在药物研发的早期阶段，研究人员通过完全验证来确定实验方法的可行性和准确性。此时，验证工作的重点在于确保每一个实验步骤的严谨性，以避免任何潜在的误差或偏差影响研究结果。例如，在药物化学或生物学特性研究中，完全验证有助于排除背景噪音的干扰，确保实验数据的可靠性。

2、临床前及临床试验阶段
进入临床前和临床试验阶段后，完全验证变得更加关键。此时，药物的安全性和有效性测试必须以高度可靠的数据为基础。通过完全验证，研究团队可以确保分析方法在药物代谢、毒理学研究中具有一致性和可靠性。这为后续的临床试验提供了坚实的基础，降低了因实验方法不当而导致的失败风险。

3、生产及质量控制
在药物正式进入市场前的生产和质量控制阶段，完全验证更是不可或缺。此时，生产过程中的每一个步骤都必须经过验证，以确保最终产品的质量稳定。完全验证的实施，不仅包括对生产工艺的验证，还涵盖了对产品的最终检测方法的验证，确保每一批次的药物都符合预期的质量标准。
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）作为一种方便灵活的均相检测技术，现今已成为生命科学基础研究和药物研发中最为常用的检测方法之一。所以，完全验证相对于TR-FRET技术非常重要。

完全验证包括以下几方面核心要素：
1.  特异性（Specificity）
在复杂的生物基质中，分析方法必须能够准确区分目标化合物与其他可能干扰物质。完全验证过程中，特异性测试是确保药物成分在检测中不会受到干扰的重要手段。

2.  灵敏度（Sensitivity）
药物开发中的微量成分检测需要高度灵敏的方法。完全验证通过评估方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），确保即使是低浓度的药物成分也能被准确检测。

3.  准确性与精密度（Accuracy and Precision）
验证过程中，方法的准确性和精密度必须得到充分评估。准确性确保检测结果与真实值的接近程度，而精密度则保证了重复检测时的一致性。

4.  线性范围（Linearity Range）
为了适应不同浓度样品的检测需求，完全验证还需确认方法在不同浓度范围内的线性关系，确保数据的可靠性。

5.  稳健性（Robustness）
稳健性测试验证了方法在面对不同实验条件变化时的稳定性，确保在各种操作条件下结果的一致性。
总之，TR-FRET完全验证是确保实验结果准确性和可靠性的关键步骤，对于科学研究和药物开发等领域具有重要意义。
THUNDER TR-FRET，作为TR-FRET技术的领先者，它，做了那些完全验证（Full Validation）呢？小编给大家说上一二...

一、细胞因子—灵敏度（SENSITIVITY ）
在进行灵敏度验证时，需要考虑样本中细胞因子的浓度范围、检测方法的最低检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）。此外，还需要评估检测方法的特异性，确保检测结果不受其他物质的干扰。通过比较不同检测方法的结果，可以帮助选择最适合特定研究目的的细胞因子检测技术。实验中使用的试剂、缓冲液和操作步骤的微小变化都可能影响细胞因子的检测。因此，实验条件的标准化和严格控制对于获得可靠结果至关重要。
 

图：Human IFNγ KIT SENSITIVITY验证

 图：Human IL2 KIT SENSITIVITY验证

THUNDER全部Biomaker灵敏度验证均展示在TDS中。

二、细胞因子—精密度（PRECISION）
1、细胞因子—INTRA-ASSAY PRECISION
在细胞因子检测中，分析内测定重复性（Intra-assay Precision）是指在相同实验条件下，对同一样本进行多次测量所得结果之间的一致性。它反映了实验操作的稳定性和可靠性，是评估检测方法性能的重要指标之一。分析内重复性的高低直接影响到实验结果的可信度和实验数据的统计分析质量。分析内测定重复性验证的重要性：
①确保数据可靠性：高的内测定重复性意味着实验结果稳定，可以减少随机误差，提高数据的可靠性。
②提高实验效率：良好的内测定重复性可以减少重复实验的次数，节省时间和成本。
③支持统计分析：在进行统计分析时，需要假设数据具有一致性。高的内测定重复性可以确保统计分析的有效性。
④满足质量控制要求：在临床和科研领域，内测定重复性是质量控制的重要组成部分，对于确保检测结果的准确性和一致性至关重要。
⑤促进结果比较：良好的内测定重复性使得不同实验、不同实验室之间的结果具有可比性，有助于数据的共享和验证。
THUNDER检测，在同一板上分别对三个已知浓度（低、中、高）的样品进行了20次测试，以评估分析内重复性。该检测在384孔板中进行，标准品和样品在Assay Buffer 1中制备。得到的低%CV（<10%）每个样品都表明检测中具有良好的重现性。
 

图：Human IFNγ KIT INTRA-ASSAY PRECISION验证

 图：Human IL2 KIT INTRA-ASSAY PRECISION验证

THUNDER全部Biomaker分析内重复性验证均展示在TDS中。

2、细胞因子—INTER-ASSAY PRECISION
在细胞因子检测中，分析间测定重复性（Inter-Assay Precision）是指在不同时间点、不同批次或不同操作者之间进行相同样本的多次测量所得结果之间的一致性。间测定重复性是评估检测方法在不同实验条件下的稳定性和可靠性的重要指标，对于确保实验结果的准确性和可重复性至关重要。分析间测定重复性验证的重要性：
①实验结果的可比性：高间测定重复性意味着不同实验批次或不同实验室之间的结果具有可比性，有助于数据的共享和验证。
②实验方法的稳健性：重复性高表明实验方法对实验条件的变化不敏感，即使在不同的实验环境中也能获得一致的结果。
③质量控制：在临床和科研领域，间测定重复性是质量控制的重要组成部分，对于确保检测结果的准确性和一致性至关重要。
④统计分析的可靠性：在进行统计分析时，需要假设数据具有一致性。高的间测定重复性可以确保统计分析的有效性。
⑤实验设计的优化：通过评估间测定重复性，可以帮助研究者优化实验设计，减少不必要的重复实验，提高实验效率。
THUNDER评估分析间重复性测试了3个已知浓度的样品。使用两个批次试剂盒进行实验：384孔板，标准品和样品均用Buffer制备，三复孔检测。每个样品CV<10%，表明具有良好的重现性。
 

图：Human IFNγ KIT INTER-ASSAY PRECISION验证

图：Human IL2 KIT INTER-ASSAY PRECISION验证

THUNDER全部Biomaker分析内和分析间重复性验证均展示在TDS中。

三、细胞因子—准确性（ACCURACY）
细胞因子的加标回收率（Spiked recovery）是评估细胞因子检测方法准确性的一个重要参数。它通过在已知浓度的样本中加入一定量的标准品，然后通过检测来评估检测方法能否准确测量出加入的标准物质的量。加标回收率的高低可以反映出检测方法的准确性、可靠性以及是否存在系统误差。通常，一个可接受的加标回收率范围会在85%-115%之间，这表明检测方法具有较好的准确性和可靠性。细胞因子的加标回收率的重要性：
①评估检测方法的准确性：加标回收率能够检验检测方法是否能够准确测量出样本中细胞因子的浓度，从而评估方法的有效性。
②质量控制：在实验室日常操作中，通过测定加标回收率可以作为质量控制的手段，确保检测结果的稳定性和可靠性。
③方法优化：如果加标回收率不理想，可能需要对检测方法进行优化，比如调整样品处理流程、改进检测条件等，以提高检测的准确性。
THUNDER回收率测定，每个分析由一条标准曲线和三条标准曲线组成加标浓度（低、中和高），在Buffer、DMEM和RPMI（含10%FBS）中三复孔检测。根据9个孔的平均值计算平均回收率，并与在相应稀释剂中制备的标准曲线进行比较。数据显示，回收率值在80–120%范围内，表明分析准确可靠。
 

图：Human IFNγ KIT RECOVERY验证

 图：Human IL2 KIT RECOVERY验证

THUNDER全部Biomaker回收率验证均展示在TDS中。

四、细胞因子—稀释线性（LINEARITY）
细胞因子的稀释线性是指在进行细胞因子检测时，将样品进行系列稀释后，检测结果与稀释倍数之间是否呈现出良好的线性关系。这一指标对于确保检测方法的准确性和可靠性至关重要，尤其在样品中细胞因子浓度远高于标准曲线上限时，或者当样品基质可能影响检测结果时。细胞因子的稀释线性验证的重要性：
①确保检测准确性：稀释线性的验证可以帮助确定在不同稀释度下检测结果的准确性，确保即使在高浓度样品中也能获得准确的细胞因子浓度读数。
②评估基质效应：通过稀释线性实验，可以评估样品基质对检测结果的影响，如血清、血浆或细胞培养上清等样品基质可能存在的干扰物质。
③优化样品处理：良好的稀释线性可以指导实验者选择合适的样品稀释倍数，以减少样品处理过程中的变异和潜在的误差来源。
④提高实验效率：当稀释线性得到验证时，可以在后续实验中直接应用，减少需要进行的预实验数量，提高整体实验的效率。
⑤数据解释和报告：在实验报告中提供稀释线性的数据可以增加结果的可信度，使其他研究者能够评估实验方法的适用性和检测结果的可靠性。
THUNDER评估分析的稀释线性，含10%FBS的培养基中加入高浓度分析物的样品并稀释。384孔板，含10%FBS培养基梯度稀释标准品。每个样品三复孔检测。数据显示，回收率值在80-120%之间，证实了分析的稀释线性好。
 

图：Human IFNγ KIT LINEARITY验证

 图：Human IL2 KIT LINEARITY验证

THUNDER全部Biomaker稀释线性验证均展示在TDS中。

五、磷酸化蛋白—稳健性（ROBUSTNESS）
Z'因子（Z'-Factor，以下简称Z值）是一个用于评估高通量筛选实验质量的统计参数，它结合了信号区间和变异性，用来预测实验方法在全高通量筛选中的适用性。Z值范围从0到1，值越大表示实验的信号窗口越好，变异性越小。一般而言，一个好的实验其Z值大于0.5，此时信号与背景的区分度较高，变异系数（CV）通常小于20%。
在时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术中，磷酸化蛋白的检测Z值可以用来评估实验方法的准确性和重复性。通过计算实验中阳性对照和阴性对照的均值和标准差计算Z值，从而来判断实验方法是否适合于进一步的研究或药物筛选。
研究人员需进行多次实验并计算Z值以确保磷酸化蛋白检测的准确性。如果Z值较低，需要优化实验条件，如：调整试剂浓度、改进样品处理方法或使用不同的检测抗体，以提高实验的信号窗口和降低变异性。Z'值成为磷酸化蛋白的检测一个重要的质量控制（QC）指标。
THUNDER Phospho-STAT3检测使用HELA细胞（100,000个细胞/孔）在无IFNα-2b和10nM IFNα-2b室温孵育60分钟。Z值为0.94，表明该检测稳定可靠，适合HTS。
THUNDER Phospho-STAT6检测使用HELA细胞（100,000个细胞/孔）在无IL-4和有1 nM IL-4的情况下室温孵育20分钟。这Z值为0.86，表明该检测稳定可靠，适合HTS。
   

图：（左）Phospho-STAT3, Z’-factor value of 0.94.（右）Phospho-STAT6, Z’-factor value of 0.86 .

六、磷酸化蛋白—Choose cell lines 
使用不同细胞系进行TR-FRET磷酸化蛋白检测实验的验证是确保研究质量、可靠性和科学价值的重要步骤。
在TR-FRET磷酸化蛋白检测实验中，使用不同细胞系进行验证的重要性体现在以下几个方面：
①确保实验结果的准确性和可重复性：不同细胞系可能对实验条件和化合物的反应存在差异，通过在多种细胞系中进行验证，可以确保实验结果的普遍性和可靠性 。
②揭示细胞系特异性的生物学特性：不同细胞系可能表达不同的蛋白水平，这可能会影响磷酸化蛋白检测的结果。通过在多种细胞系中进行实验，可以更好地理解特定细胞环境下的生物学过程 。
③评估药物或化合物的作用机制：在不同细胞系中验证可以帮助研究者了解药物或化合物的作用是否具有细胞系特异性，从而为药物开发和疾病治疗提供重要信息 。
④避免细胞系交叉污染的影响：细胞系交叉污染是一个常见问题，可能导致实验结果的不准确。使用不同细胞系进行验证可以帮助识别和排除这种污染的影响 。
THUNDER Phospho-STAT6 使用HELA细胞（100,000个细胞/孔，三复孔）与IL4室温孵育30分钟。数据显示IL-4可明显刺激HELA细胞STAT6 Y641位点的磷酸化。
THUNDER Phospho-STAT6将使用THP-1细胞（200,000个细胞/孔，三复孔）与IL-4室温孵育20分钟。数据显示，IL-4可明显刺激THP-1细胞STAT6 Y641位点的磷酸化。
   

图：STIMULATION OF PHOSPHO-STAT6 (Y641) IN HELA and THP-1 CELLS

THUNDER Phospho-Ext ERK使用H358细胞（5K、10K、20K和40K细胞/孔，三复孔），血清饥饿18小时。抑制剂RMC-4550在37°C孵育60分钟。数据显示，用RMC-4550处理H358细胞会抑制ERK1/2在T202/Y204位点的磷酸化。
THUNDER Phospho-Ext ERK使用MCF7细胞（5K、10K、20K和40K细胞/孔，三复孔）。将细胞与抑制剂L779,450在37°C下孵育30分钟。数据显示，用L779,450处理MCF7细胞会抑制ERK1/2在T202/Y204位点的磷酸化。
   

图：INHIBITION OF BASAL PHOSPHO-ERK1/2 (T202/Y204) IN H358 and MCF7 CELLS

六、磷酸化蛋白—CONTROL LYSATE TITRATION 
磷酸化水平实验时，阳性细胞裂解物的titration检测是必要的质量控制（QC）测试，是确保实验结果准确性和可重复性的关键步骤。
THUNDER Phospho-SMAD2（S465/S467）使用TGFβ 处理的HELA细胞进行了测试。HELA细胞血清饥饿3小时并用0.3 nM TGFβ 处理，室温孵育60分钟。4mL裂解液裂解细胞并连续稀释，三复孔进行测试。数据显示，裂解物之间存在良好线性关系稀释度和Ratio值。
THUNDER Phospho-IRβ（Y1150/Y1151）检测使用胰岛素处理的B淋巴细胞裂解物进行检测。B淋巴细胞离心并用无血清RPMI重悬。用100nM胰岛素37°C刺激20分钟。细胞裂解后连续稀释，三复孔进行测试。数据显示，裂解物稀释度与Ratio呈现良好线性关系。
   

图：（左）phospho-SMAD2 (S465/S467) CONTROL LYSATE TITRATION.（右）Phospho-IRβ (Y1150/Y1151) CONTROL LYSATE TITRATION

七、批次稳定性检测—Lot to lot QC 
为了确保试剂盒的批次稳定性，需要进行严格的质量控制和稳定性研究，包括实时稳定性（长期稳定性）、加速稳定性、运输稳定性和开封稳定性等测试。这些测试有助于确定产品的储存条件、检验周期和产品有效期，确保产品在不同环境条件下的性能保持一致。
试剂盒的批次稳定性至关重要，因为它直接影响到实验结果的可重复性和可靠性。以下是批次稳定性的几个重要方面：
①确保实验结果的一致性：批次稳定的试剂盒可以确保不同批次的试剂在相同的实验条件下产生相似的结果，这对于实验的可重复性和数据的比较分析非常重要。
②减少实验误差：稳定的试剂盒可以减少由于试剂质量波动引起的实验误差，从而提高实验结果的准确性。
③简化质量控制流程：稳定的试剂批次可以减少实验室对每批试剂进行单独验证的需要，从而简化质量控制流程并节省资源。
④降低成本：批次稳定的试剂盒可以减少由于质量问题导致的浪费，降低实验室的运营成本。
THUNDER 每款试剂盒均进行严格的批间稳定性测试，批次间一致性好。每个新的批次可以保证与前批次灵敏度，检测范围保持一致。以下是THUNDER cAMP Assay 批次间检测示意图：
  

图：THUNDER cAMP lot to lot QC

八、不同仪器/光源引起的差异验证
使用不同酶标仪进行TR-FRET检测时，可能会遇到检测结果的差异。这些差异可能由以下几个因素造成：
①仪器的激发和发射波长配置：不同酶标仪可能有不同的滤光片配置，这可能影响激发和发射波长的准确性，从而影响检测结果 。
②光源类型：例如，氙闪灯和激光光源在激发能量和稳定性方面可能有所不同，这可能导致信号强度和信噪比的变化 。
③时间分辨设置：TR-FRET技术依赖于在激发和检测之间设置特定的时间延迟，以排除短寿命背景荧光。不同仪器的时间延迟和积分时间设置可能不同，这会影响最终的信号检测 
④仪器的灵敏度和动态范围：不同酶标仪的检测器和电子系统可能有不同的灵敏度和动态范围，这可能导致对弱信号或高浓度样品的检测能力不同。
THUNDER human IFNγ 使用缓冲液稀释标准品，三复孔，使用同台酶标仪不同光源LAMP和LASER进行检测，得出LOD分别为32pg/ml，21pg/ml。
   

图：（左）THUNDER human IFNγ LAMP光源；图：（右）THUNDER human IFNγ LASER光源

THUNDER Phospho-BTK Raji 细胞（200,000个细胞/孔，三复孔）使用96孔培养板铺板，过钒酸盐在37℃孵育30分钟。数据显示，用过钒酸盐处理Raji细胞，可引起BTK 在Y223位点的磷酸化。不同酶标仪信噪比为5.5和6.5，仪器数据呈现些许差别。
THUNDER Phospho-AKT（S473）MCF7细胞（60,000个细胞/孔，三复孔）IGF-1室温孵育10分钟。IGF-1处理的MCF7细胞可以引起AKTpan在S473位点的磷酸化。不同酶标仪信噪比为4.7和5.3，仪器数据呈现些许差别。
   

图：（左）THUNDER Phospho-BTK（Y223）不同仪器验证；图：（右）THUNDER Phospho-AKT（S473）不同仪器验证

THUNDERTM TR-FRET由加拿大Bioauxilium公司研发，THUNDER™产品均提供全面验证数据。其产品线聚焦于细胞水平的检测，如细胞信号通路相关的细胞因子，磷酸化蛋白，总蛋白，GPCR相关第二信使cAMP检测等，也涉及适合方法学开发的工具抗体。

上海优宁维生物科技股份有限公司

试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链

免费热线：4008-168-068

咨询邮箱：info@univ-bio.com

订购商城：www.univ-bio.com

微信公众平台：优宁维抗体专家，欢迎关注！

小优博士（小程序）：5大课堂, 让你的科研不再难！