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无论是刚入门细胞培养的小白，还是轻松拿捏各类细胞的大神，都遭受过细胞污染的困扰：细菌？真菌？支原体？黑胶虫？头昏脑胀分不清。别慌，优宁维来啦！小优教你细胞污染辨别-拯救组合拳，成为课题组细胞培养最靓的仔。
 

细胞污染可以分为物理污染、化学污染和生物污染。细菌、真菌、支原体和黑胶虫就属于生物污染，这些污染频率高，难控制，是不少科研人的噩梦。

细菌污染
细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米(μm)计，常见革兰氏阴性菌有大肠杆菌、假单胞菌等。
来源：通常是操作不规范或无菌措施不到位等引起

特点：
细菌呈球状、杆状和螺旋状，大小为0.5~5μm
营养消耗快、培养基浑浊、变黄，pH值下降
显微镜下可见明显的定向运动 
肉眼下观察到“细沙”
胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡

细菌污染的处理方法：
预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量5-10倍的冲洗法，加药后作用12-24小时，再换常规培养液；此法在污染早期有效。
 

图1被大肠杆菌污染的293细胞

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真菌污染
细胞培养中最常见的污染真菌有：霉菌、酵母菌、烟曲霉、黑曲菌、白色念珠菌等。这里以霉菌为例：
来源：多来自空气，如做实验时说话聊天、瓶口敞开时间太长、培养箱开关频繁都是可能原因
特点：
培养基较迟浑浊，但会漂浮着白色或浅黄色的小点
低倍镜下可见呈细丝状、树枝状或团状漂浮物
细胞增殖相对缓慢，活力差
污染难以去除，容易影响其他细胞
真菌污染的处理方法：
真菌会产生大量孢子，孢子会随着空气扩散到整个细胞培养间，因此真菌污染必须直接将污染物移除培养间丢弃，切不可在培养间内打开培养器皿，做好预防尤其重要。
迅速检查周围细胞是否有污染，将未污染的细胞移至新的培养箱。发现污染的培养箱用清水和酒精多擦拭几遍，然后彻底消毒灭菌培养间，CO2孵箱，器皿等。
 

图2 霉菌污染

支原体
支原体是一种微小、悬浮、自我复制的有机体，一般大小为0.2-0.8 µm，可通过滤菌器，并且，大部分的抗生素对支原体无效。
来源：
实验操作者（裸露的皮肤、头发、无菌操作不规范）
实验材料（原代组织细胞分离、自配试剂、培养基）
实验环境及器材污染
细胞之间交叉污染

特点：
光镜下无法观察到
污染初期没有明显的感染征象
细胞生长增殖变慢，部分会变圆，从瓶壁脱落
影响细胞脂质体的转染和细胞电转染效率

支原体污染的处理方法：
培养细胞一经支原体污染，多数较难处理，一定要提前预防。如果污染细胞价值不大，弃之。有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再进行培养。
若污染的细胞价值较大，难于重新得到，可使用商品化的支原体清除试剂清除。
 

图3 支原体污染前（左）后（右）对比

黑胶虫
来源：
黑胶虫其实是细胞培养过程中使用的血清的沉淀物：纤维蛋白、磷酸钙、胆固醇等。沉淀的产生原因很多，如热灭活血清；反复冻融；长期储存在4℃；室温或37℃水浴锅中融化；在室温下放置时间过长。

特点：
纤维蛋白通常为肉眼可见的较大物质（可达1-2mm），即絮状沉淀；磷酸钙在显微镜观察为小黑点，由于布朗运动，通常被误认为是微生物污染。血清中的沉淀往往比较难以预测和控制，但是这些沉淀不会影响血清的质量。

黑胶虫的处理方法：
血清中的絮状沉淀（脂蛋白、纤维蛋白），它不会影响血清本身的质量，可以5000×g离心5-10 min去除，也可不处理。
正确使用血清也可以有效避免沉淀的产生：非必要，不用热灭活；避免反复冻融；-20℃保存；4℃全融（期间间断摇晃均匀）；5000rpm离心5分钟或用0.22um滤膜过滤 ，取上清使用。
 

图4 血清沉淀“黑胶虫”

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