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特发性肺纤维化（IPF）描述了一种慢性和进行性肺部疾病，会造成永久性肺功能丧失和纤维化重塑。在损伤肺泡修复过程中，肺泡II 型上皮细胞（AT2细胞）是重要的干细胞群体，能够在损伤后自我扩增并分化为肺泡 I 型上皮细胞（AT1细胞）。考虑到AT2细胞在治疗IPF进展中的关键作用，维持AT2干细胞特性以促进肺泡修复被认为是一种有前途的治疗策略。

与健康肺相比，IPF肺的AT2细胞中 CYB5R3 mRNA 和蛋白水平的下调不仅与 NAD+/NADH 失衡相关的线粒体稳态有关，还参与转化生长因子-β1（TGF-β1） 信号转导异常激活；在肺纤维化的病理学中，持续抑制骨形态发生蛋白-4（BMP4）的信号会促进AT2异常增殖和成纤维细胞基质合成，导致瘢痕形成和肺泡塌陷。

为此，CYB5R3和BMP4的高表达都可能有助于恢复肺上皮胞的纤维化，可作为候选mRNA治疗药物。

基于mRNA的治疗已经成为各种临床领域中一种安全且有效的治疗形式，例如病毒疫苗、蛋白质替代疗法、基因组编辑和癌症免疫疗法。然而，mRNA介导的治疗高度依赖于优化的递送载体和合适的给药途径。雾化吸入作为一种简单易行的方法，由于其独特的优点，被认为是临床上治疗呼吸系统疾病最有前途的方法之一。与此同时，随着治疗技术的快速发展，基于纳米颗粒的递送系统已广泛用于肺部疾病治疗。靶向呼吸上皮细胞的雾化LNP将是IPF治疗中基于mRNA的蛋白质替代疗法的理想选择，可以在肺部实现累积并滞留。但雾化给药存在强剪切力问题，且肺部具有粘膜层、吞噬细胞等特异性的屏障，这些原因在一定程度上阻碍了吸入mRNA疗法的功效。

研究表明，使用肺表面成分作为纳米颗粒表面涂层可通过界面递送改善在粘液屏障上的扩散，可以更好地靶向深层肺组织和上皮细胞摄取以进行药物递送。受此启发，研究人员将肺表面活性剂中丰富的磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱 （DPPC） 掺入LNP成分中，以制备具有粘液渗透性的肺表面活性剂仿生 LNP。

基于以上背景及发现，山东大学姜新义教授研究团队在 《Science Advances》上发表了题为“Realveolarization with inhalable mucus-penetrating lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary fibrosis in mice”的创新性研究成果。该团队开发了一类基于 γ-氨基丁酸 （GABA） 的可电离脂质并优化LNP配方，通过体外筛选实现高效 mRNA 递送。优化的 LNP同时封装递送了BMP4和CYB5R3 mRNA，以调节AT2干细胞耗竭并进行IPF治疗（图 1）。结果表明，mRNA-LNP系统在肺上皮细胞中显示出高蛋白表达，摆脱了肺泡塌陷问题并延长了纤维化小鼠的存活时间，提供了一种可行的临床对抗IPF的策略。

图1 mRNA-LNP 吸入递送至 AT2 细胞以逆转上皮干细胞耗竭治疗IPF

✦ mRNA 递送的吸入 LNP 的筛选和优化

通过使用简单的取代和酯化反应将烷基尾和胺基头与γ-氨基丁酸连接键反应，生成可电离脂质库（图2B）。为了确定最佳的候选处方，按照正交设计表制备LNP（图2C）和表 S1）。涉及到的辅助脂质材料：DOPE、DPPC、DSPE-PEG2000和胆固醇。主要包载EGFP mRNA或FLuc mRNA用于后续体外筛选和体内吸入筛选最佳处方（图2D）。

图2  吸入mRNA LNPs处方筛选组合方案及制备方法

多种处方的相容性和最显著的转染效率（图3A）。为了获得 GAE14 的最佳配方，表征了五种主要候选配方 （GAE14A、GAE14E、GAE14L、GAE14M 和 GAE14N） 的大小、表面电荷、mRNA包封率和稳定性。结果表明，五种制剂雾化前后的 zeta 电位没有显着变化，但粒径和PDI有不同幅度增加（图3B和C），包封率也有所下降。其中 GAE14M 和 GAE14N 似乎更好地将 mRNA 保留在雾化 LNP 中（图3D），但雾化后GAE14N 在上皮细胞中实现了最佳的转染效率（图3E）。考虑到转染效率、理化性质的稳定性等因素，最后选择了GAE14N处方来制备 LNPs。为了改善细胞对LNP的摄取，对LNP进行SP-A（肺表面活性蛋白A）抗体修饰（用 DSPE-PEG2000-NHS取代PEG 脂质，以相同的方法制备SLNPs），共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术测定显示MLE12 细胞中SP-A 抗体修饰的SLNPs细胞摄取率更高（图3I）。

图3 吸入mRNA LNPs处方体内筛选试验

筛选出的最佳配方为：SP-A 抗体修饰的GAE14N，脂质成分摩尔比：GAE14:胆固醇:DSPE-PEG2000-NHS:DOPE+DPPC =45:25:2.5:10（DOPE/DPPC=3/1）。随后，同时封装BMP4和CYB5R3 mRNA进行体内外递送效率、表达情况、治疗效果及生物安全性的评估。

总之，研究团队成功开发了一种可吸入的 LNP，显示出深层肺渗透和胞质 mRNA 递送，以介导 AT2 细胞中高效的 CYB5R3 和 BMP4 翻译。值得注意的是，LNP 通过抵抗 AT2 干细胞的耗竭以及成纤维细胞的异常激活来重塑肺结构，从而有效地逆转了 IPF。此项工作通过恢复上皮干细胞的功能来实现肺泡稳态和修复，为解决IPF可逆治疗中未满足的需求提供了一种创新选择。