如何检测聚集小体

1. 聚集小体的生物学作用是什么？

聚集小体是泛素-蛋白酶体机制被错误折叠和聚集的蛋白质压垮时形成的包涵体。通常情况下，聚集小体的出现往往也表明细胞正处于某种应激状态，比如高温、病毒感染、活性氧自由基攻击等。聚集小体或类聚集小体包涵体能封存有毒的聚集蛋白，从而起到保护细胞的作用。聚集小体的形成还有助于通过自噬-溶酶体途径降解聚集蛋白。分子伴侣和泛素-蛋白酶体系统降解折叠错误的蛋白质等平衡机制有助于防止蛋白质聚集小体的形成。

2. 为什么必须测量细胞中的聚集小体？

聚集小体在神经退行性疾病中发挥着重要作用。过度磷酸化的 tau 蛋白聚集形成神经纤维缠结，β-淀粉样蛋白聚集形成淀粉样蛋白斑块，它们都与阿尔茨海默症有关。路易体（Lewy）主要由聚集的泛素和α-突触核蛋白组成，常见于帕金森病患者的神经元中。马洛里小体（Mallory）与酒精性肝病患者的肝细胞有关。在亨廷顿病中，亨廷顿基因突变会导致变异HTT蛋白的表达，这种蛋白容易聚集并干扰神经元的功能。在真实的细胞环境中检测聚集小体有助于更好地了解与聚集小体相关的疾病。聚集小体形成的检测为鉴定抑制聚集小体形成的化合物提供了宝贵的读数，可能在治疗神经退行性疾病方面发挥重要作用。

3．如何检测凝集体？

有几种方法可以检测细胞中的凝集体。比如可以使用透射电子显微镜以及聚丙烯酰胺凝胶电泳，并结合 WB实验。但是，这两种方法都不适合高通量研究，因为它们非常耗时，而且生成的数据难以解读。荧光显微镜可用于标记蛋白质，在将其转染到培养细胞后可对其聚集情况进行研究。但是，这种方法取决于可检测到的标记蛋白质的数量，这可能会限制研究，甚至还可能影响蛋白质的聚集动力学。例如，GFP 蛋白（238 个氨基酸）比 β 淀粉样肽（39-43 个氨基酸）大得多，可能会阻碍凝集小体的形成。

4. PROTEOSTAT® 检测技术有哪些优势？

PROTEOSTAT^® Aggresome detection kit（ENZ-51035-0025）提供了一种快速、特异和定量的方法，可在真实的细胞环境中鉴定与神经退行性疾病相关的抑制剂。这种固定细胞检测不需要非生理性蛋白质突变或基因工程细胞系。PROTEOSTAT^® Aggresome 检测试剂盒含有一种新型 488 nm可激发红色荧光分子转子染料，可特异性检测固定和通透细胞中聚集小体和类聚集小体包涵体中的变性蛋白质货物。PROTEOSTAT® 染料已在多种条件下与小分子调节剂一起进行了验证，证明适用于筛选具有潜在治疗价值的化合物，并为抗体共定位研究进行了优化，以确定聚集蛋白货物与自噬和聚集小体形成过程中涉及的各种蛋白之间的相互作用。

ROTEOSTAT^® 检测技术的主要特点包括：

1.可靠而简单的检测方法，无需非生理性蛋白质突变或基因工程细胞系；

2.固定细胞检测法经过优化，可用于抗体共定位研究，以确定聚集蛋白货物和与聚集小体形成有关的各种蛋白之间的相互作用；

3.已在多种条件下进行了验证，证明适用于筛选具有潜在治疗价值的化合物；

4.可通过流式细胞仪和显微镜轻松量化聚集小体的积累；

图 1. PROTEOSTAT® Aggresome 染料的激发光谱和荧光发射光谱，ex/em 500/600 nm（图 A）和 Hoechst 33342 的 ex/em 350/461 nm（图 B）。所有光谱均在 1X 分析缓冲液中测定。

图 2. PROTEOSTAT® Aggresome 染料可通过荧光显微镜检测聚集小体内的蛋白质积累。用 0.2% DMSO（图 A）或 5 μM MG-132（图 B）在 37°C 下模拟诱导 HeLa 细胞 12 小时。处理后，用 PROTEOSTAT® Aggresome 染料孵育细胞 30 分钟。

图 3. 荧光显微镜观察到 PROTEOSTAT® 染料检测到的细胞聚集小体与荧光素标记的识别 LC3I/II 的抗体共定位。在载玻片上用 5 μM MG-132 处理 HeLa 细胞 12 小时，并用 (A) PROTEOSTAT® 染料和 (B) 识别 LC3I/II 的荧光素标记抗体染色；(C) 显示的是复合图像。

图 4. 基于流式细胞仪的分析。用 0.2% DMSO 或 5 μM MG-132 在 37°C 下模拟诱导 Jurkat 细胞过夜。处理后，固定细胞并用 PROTEOSTAT® 染料孵育，然后在 FL3 通道使用 488 nm 激光进行流式细胞术分析，无需清洗。在经 MG-132 处理的细胞中，荧光红色信号增加了约 3 倍。所述检测方法可评估蛋白质聚集的影响。

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