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抗体应用和技术

抗体是用于各种实验室技术的强大研究工具。在此，我们将简要介绍最流行的实验室技术，重点介绍它们如何使用抗体。

酶联免疫吸附实验(ELISA)

ELISA是一种基于平板的技术，可以检测生物样本中的抗原。与其他免疫测定方法一样，ELISA依靠抗体与抗原的高度特异性相互作用来检测目标抗原。ELISA可以对分析物和分子相互作用进行定量和定性。

在酶联免疫吸附实验中，抗原被直接固定在固体表面上，或者更常见的是通过捕获抗体固定在表面上(图1)。表面经过洗涤，然后与酶或荧光团等分子连接的检测抗体一起孵育。

在抗原存在的情况下，这些检测抗体会与平板保持结合，产生信号。信号的强度与样本中的抗原浓度相对应。

图1:夹心酶联免疫吸附实验装置。多孔板上的捕获抗体将固定感兴趣的抗原。与生物素和链霉亲和素-HRP结合的检测抗体将识别并结合该抗原。

ELISA通常在多孔板(96孔或384孔)中进行，分析物的固定化有助于将抗原与其他样品成分分离。这些特点使ELISA成为最容易同时对多个样品进行检测的方法之一。

酶联免疫吸附法主要有四种：直接法、间接法、夹心法和竞争法，每种方法都有其独特的优缺点和适用性。每种实验最合适的酶联免疫吸附实验形式取决与许多因素，包括所需的灵敏度、特异性和检测时间。

酶联免疫斑点检测

酶联免疫斑点(ELISPOT)用于检测细胞分泌的蛋白质，如细胞因子和生长因子。该技术可以量化和比较对各种刺激的免疫反应。

将细胞培养在96孔板中，使用抗体包被的PVDF或硝酸纤维素膜。使用一抗和共轭二抗检测相关分泌蛋白。分泌相关蛋白的细胞会出现色斑或荧光。扫描并分析膜，量化分泌蛋白质的细胞数量或比例。

免疫印迹(WB)

免疫印迹技术广泛应用于分离和鉴定蛋白质的研究。通过免疫印迹，我们可以检测蛋白质，确定不同样本之间的相对蛋白质水平，并确定目标蛋白质的分子量，从而深入了解蛋白质的翻译后加工过程。

免疫印迹包括三个主要步骤：(1)按大小分离蛋白质，(2)将蛋白质转移到膜上，(3)使用一抗和二抗观察目标蛋白质(图2)。

第一步，将蛋白质装载到凝胶上，通过凝胶电泳按大小进行分离。然后利用电流将蛋白质条带迁移到膜上。蛋白质转移到膜上至关重要，因为用于电泳的凝胶为随后的免疫染色提供了一个较差的表面，即抗体不会粘附在凝胶的蛋白质上。

最后，用特异性抗体对膜进行进一步免疫染色，并用二抗和检测试剂对膜进行显像。

图2：免疫印迹简图

免疫沉淀(IP)和染色质免疫沉淀(ChIP)

免疫沉淀(IP)是一种分离和纯化单个蛋白质和复合蛋白质的多功能技术。在这项技术中，抗体被固定在固相基质(如磁珠/琼脂糖珠)上，从复杂的溶液中捕捉抗原。

染色质免疫沉淀(ChIP)用于确定特定蛋白质是否与体内特定DNA序列结合。通过ChIP，研究人员可以确定感兴趣的蛋白质在整个基因组中结合的特定基因和系列，为了解其调控功能和机制提供重要线索。

图3:ChIP方案工作流程。进行ChIP实验的步骤:1.交联，2.染色质片段化，3.免疫沉淀，4.DNA 回收和纯化，5.DNA 分析。

免疫组织化学(IHC)

免疫组织化学(IHC)是一种利用抗体-抗原相互作用来检测组织切片中抗原分布和定位的方法(图4)。虽然定量效果不如免疫印迹或ELISA，但IHC具有在完成组织中鉴定蛋白质表达的优势。

IHC通常用于诊断癌症等疾病的组织异常，IHC提供了宝贵的视角和支持。

IHC染色依赖于能识别目标抗原的抗体。您可以使用显色或荧光检测系统来观察抗体于抗原之间的相互作用。在色原检测中，抗体与酶结合，当抗体接触色原是会产生彩色沉淀。在荧光检测中，抗体与荧光团结合。样品制备和可视化技术多种多样，所使用的方法应根据样本类型和所需的灵敏度而定。

图4:左图为正常人扁桃体组织(福尔马林固定石蜡包埋切片)的荧光多重IHC染色。抗PD1(橙色)、抗PDL1(绿色)、抗CD68(黄色)、抗CD3(红色)、抗Ki67(淡蓝色)和抗PanCK(灰色)的合并染色。右图为用抗Ki67抗体对福尔马林固定石蜡包埋的正常人扁桃体切片进行IHC染色。

免疫细胞化学(ICC)

免疫细胞化学(ICC)是利用标记抗体研究蛋白质的亚细胞分布。与IHC不同的是，这种技术侧重于细胞样本而不是组织块。

在ICC染色中，针对相关蛋白质的抗体被应用于经过固定和通透处理的细胞培养样本。ICC有两种类型：直接和间接。直接ICC使用的是共轭的一抗，而间接ICC使用的是未共轭的一抗，然后用共轭的二抗进行检测(图5)。在大多数ICC实验中，抗体都用荧光团标记，非常适合共定位研究。各种成像技术，如宽场显微镜、共聚焦显微镜或旋转圆盘显微镜都可用于检测信号。

图5:左图是用抗PDGFRA抗体(用Alexa Flour®488二抗检测-绿色)和抗微管蛋白抗体(用Alexa Fluor®594二抗检测-红色)对SH-SY5Y细胞进行间接ICC染色。右图是用共轭的抗KRT14抗体(Alexa Fluor®647-红色)和共轭的抗微管蛋白抗体(Alexa Fluor®488-绿色)进行直接ICC检测。细胞核用DAPI(蓝色)染色。上图显示野生型细胞中的相关信号，下图显示基因敲除没有的特定信号。图像由共聚焦显微镜拍摄。

流式细胞仪和荧光激活细胞分拣

流式细胞仪是一种常用的激光技术，用于分析细胞或颗粒的特征(图13)。该技术测量混合群体中与单个细胞结合的标记抗体发出的荧光。此外，不同细胞对光的散射也可用于确定它们的大小和特性。

图6:流式细胞仪概览。

通过流式细胞仪，可以分析细胞表面和细胞内分子的表达，确定异质细胞群中不同细胞类型的特征，评估分离亚群的纯度，分析细胞大小和体积。它可同时对单个细胞进行多参数分析。

荧光激活细胞分拣(FACS)是流式细胞术的一种衍生技术，它根据荧光标记将细胞群物理分离成亚群。

参考文献

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